הפרוטוקול שלנו מציע התקדמות משמעותית בסינתזה של ננו-ג'לים עתירי חלבון תת-100 ננומטר בטכניקת קישור צולב וקו-פולימריזציה בשלב אחד בתנאי תגובה מימיים מתונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ביכולתה לסנתז ננו-ג'לים עמוסי חלבון בתנאים מתונים, תוך הימנעות מממסים אורגניים קשים וטמפרטורות גבוהות, ובכך לשמור על שלמות המטען הביולוגי. התחילו בשטיפת כלי הזכוכית במים מסוננים שעברו דה-יוניזציה.
כדי לייבש את כלי הזכוכית, חברו פייה מאובטחת לשקע האוויר הדחוס הממוקם בצד מכסה האדים. החזק את הבקבוקון בחוזקה, מקם את הזרבובית בתוכו והפעל את האוויר הדחוס כדי לפלוט זרם מבוקר. לאחר מכן, למלא בקבוקון זכוכית 10 מיליליטר עם מים deionized ולאטום אותו עם מחיצת גומי.
כדי לחמצן את המים, מלאו בלון בגז חנקן והצמידו מחט לבלון. מניחים אותו על המחיצה ומנקבים את מחיצת הגומי כדי לאפשר את זרימת החנקן. כמו כן, חברו מחט יציאה לבקבוק כדי לשמור על זרימת חנקן עקבית.
לאחר מכן, יש להמיס BSA או BSA עם תג Cy7 במים נטולי יונים. לאחר מכן הוסף פתרון זה לבקבוקון זכוכית נקי של 10 מיליליטר. הוסף תמיסת AETC לבקבוק ואטם אותו במחיצת גומי נוספת.
ממיסים אקרילאמיד ומים דה-יוניים נטולי חמצן ומוסיפים תמיסה זו לתערובת הבקבוקון. לאחר מכן ממיסים את המקשר הצלב דיסולפיד במים נטולי יונים, ומוסיפים אותו לתערובת שבבקבוקון. שטפו את התערובת בגז חנקן למשך 20 דקות.
לאחר מכן, יש להמיס SDS במים נטולי יונים. בעזרת מזרק סמוק בגז חנקן, הכניסו אותו לתערובת. לאחר מכן, הוסף TEMED לתערובת התגובה.
תנו לתערובת להתחמצן למשך שלוש דקות תחת זרימה רציפה של גז חנקן. ממיסים אמוניום פרסולפט במיליליטר אחד של מים דה-יוניים לא מחומצנים ומכניסים אותו לתערובת התגובה. לאחר מכן אוטמים את הבקבוק תחת אטמוספירת חנקן ומערבבים את התערובת במשך שלוש שעות ו -30 דקות בטמפרטורת החדר.
כדי לסיים את התגובה, הסר את החותם מהבקבוק. התגובה מסתיימת ברגע שהתערובת הופכת ברורה וחסרת צבע. כדי לטהר ננו-ג'לים, הוסף את תערובת התגובה ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 15 מיליליטר.
מלא את היחידה במים שעברו דה-יוניזציה ובצנטריפוגות כדי להסיר כימיקלים לא תגובתיים או מטען לא מכוסה. הוסף שני מיליליטר מים דה-יוניים ביחידה הצנטריפוגלית כדי לדלל את דגימת הננו-ג'ל. אחסנו את הדגימה הסופית בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס כדי למנוע פירוק של החלבון העטוף.
קח קובטה או תא נימי מקופל חד פעמי לניתוח. נקו אותו עם פילטר מים שעברו דה-יוניזציה, ולאחר מכן נשפו אוויר דחוס כדי להסיר חלקיקי אבק גדולים. לאחר מכן למלא את cuvette עם 50 עד 100 מיקרוליטר של המדגם, מדלל אותו עם 750 עד 1, 000 מיקרוליטר של מים מסוננים deionized.
כדי להכניס את הקובטה למכשיר DLS, פתח את מכסה תא הדגימה והחזק את הקובטה בקצוות העליונים שלה כדי למנוע השארת טביעות אצבע לחלונות האופטיים. מקם את הקובט מיושר כראוי עם הנתיב האופטי של המכשיר. לאחר מכן סגרו את תא הדגימה כדי לחסום את תאורת הסביבה.
התחל את מדידת גודל החלקיקים באמצעות התוכנה הרלוונטית במכשיר DLS. לאחר המדידה, בחר את התוצאות הרלוונטיות לדגימה, כולל ממוצע Z, PI ממוצע, קצב ספירה לדקה, פוטנציאל zeta וגרפיקה קשורה. ודא שפונקציית המתאם מציגה עקומה סיגמואידלית חלקה המעידה על מדגם אחיד.
לאחר השלמת הניתוח, הסר בזהירות את הקובט ממכשיר DLS. נצפתה ירידה הדרגתית בעוצמת השיא הקשורה לחלבון BSA, מה שמרמז על אנקפסולציה של החלבון בתוך מבנה הננו-ג'ל. האפיון הכימי הפיזיקלי של ננו-ג'לים עמוסי BSA המתויגים ב-Cy7 הראה שיא מוגדר יחיד של 50 עד 100 ננומטר.
עם זאת, ננו-ג'לים ריקים הדגימו גדלים לא עקביים וגדולים יותר. עד 86% מה-BSA המתויג ב-Cy7 שוחרר תוך 48 שעות. מצד שני, ניסויי בקרה ללא תוספת גלוטתיון הובילו רק לשחרור של 15% חלבון.
ניתוח אינפרא אדום של התמרת פורייה הראה כי BSA שבודד במהלך סינתזת ננו-ג'ל ולאחר דגירה של גלוטתיון שמר על המבנה שלו, כפי שמצוין על ידי השיא ב -1, 662 סנטימטרים הופכיים המייצגים סיבובי בטא שלמים. עם זאת, BSA מננו-ג'לים שאוחסנו במשך 30 יום הראה שיא של 1, 613 סנטימטרים הפוכים, מה שמעיד על מבנים בין-מולקולריים של יריעות בטא וצבירת חלבונים. דיכרואיזם מעגלי הראה ספקטרום ללא שינוי כמו BSA מקורי, מה שמצביע על מבנה אלפא סלילי שהשתמר.
עם זאת, סטיות קלות בפסגות האופייניות ל-BSA שבודדו לאחר 30 יום הצביעו על הצטברות מסוימת. שמירה על זרימת חנקן רציפה היא קריטית כדי למנוע מחמצן לעכב את פילמור הרדיקלים החופשיים. בנוסף, רכיבי המערכת היוזמים דורשים חיבור מהיר לסינתזה מוצלחת.
לאחר הליך זה, ניתן להמשיך ולאפיין קינטיקה של פיזור בגודל ננו-ג'ל, מורפולוגיה וקינטיקה של שחרור מטענים באמצעות DLS, TEM והערכת תגובתיות חמצון-חיזור באמצעות דגירה עם חומר ההפחתה הפיזיולוגי גלוטתיון.
