Bu protokol önemlidir, çünkü bir sentez tesisinden alınan küçük bir gen parçasından hücresiz reaksiyonlarda kullanılmak üzere hızlı bir şekilde büyük miktarda DNA şablonunun nasıl oluşturulacağı ayrıntılı olarak açıklanır. Yuvarlanan daire amplifikasyonu, geleneksel klonlamadan daha hızlı büyük miktarlarda DNA üretebilir. Bu nedenle, sentetik DNA kütüphanelerinden daha yüksek verim tasarımı oluşturma testi öğrenme döngülerini destekler.
Bu teknikler, gerekli birçok adım ve küçük hacim nedeniyle yeni kullanıcılar için büyük bir doğal değişkenliğe sahip olabilir. Tekniğe dikkat edilmeli ve uygulama mükemmel hale getirilmelidir. Başlamak için, bir PCR kitinden tüm bileşenleri tek bir PCR tüpüne ekleyin.
Daha sonra yeniden dirilen gen parçasından bir mikroliter ekleyin. Orta bir ayarda beş ila 10 saniye boyunca girdaplayarak karışımı hafifçe homojenize edin. Termosikleyiciyi kit üreticisinin protokolüne göre programladan sonra PCR'yi çalıştırın.
PCR tamamlandıktan sonra, DNA'yı reaksiyon karışımından arındırmak için bir PCR temizleme kiti kullanın. 1,5 mililitrelik bir tüpte, DNA bağlama tamponu ve PCR örneğini beş ila bir oranında ekleyin. Bu karışımı bir dakika boyunca 16.000 kez G'de spin sütununa ve santrifüje aktarın.
Akışı atın. Kolona 200 mikrolitre DNA yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın. Sütunu tekrar santrifüj edin ve akış içini atın.
Gösterildiği gibi, sütunu DNA yıkama tamponu ile bir kez daha yıkayın. Akışı ikinci yıkamadan attıktan sonra, sütunu bir ila iki dakika daha santrifüj ederek kalan arabelleği çıkarın. DNA'yı elüte etmek için sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.
Daha sonra sütuna 46 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Bir dakikalık bir inkübasyondan sonra, DNA'yı santrifüjleme ile tüpe toplayın. Ve spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA'yı ölçün.
DNA'yı sindirmek ve daireselleştirmek için, gerekli reaksiyon tamponunun beş mikrolitresini, HindIII kısıtlama enziminin 20 birimini ve saflaştırılmış DNA'nın 45 mikrolitresini bir PCR tüpünde birleştirin. Bir pipet kullanarak, bu karışımı hafifçe homojenize edin. Daha sonra 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir termosikler içinde kuluçkaya yatırın.
Kuluçka tamamlandıktan sonra, ısı HindIII enzimini 80 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırarak inaktive eder. Daha sonra yeni sindirilen DNA'ya beş mikrolitre T4 Ligaz tamponu ve 800 ünite T4 Ligaz ekleyin. Bir pipetle hafifçe karıştırdıktan sonra, daireselleştirme reaksiyonunu gerçekleştirmek için karışımı 25 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Reaksiyon tamamlandıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı arındırın. O zaman DNA'yı ölç. Yuvarlanan daire amplifikasyonu gerçekleştirmek için, tüm reaksiyon bileşenlerini ve saflaştırılmış dairesel ifade şablonunun bir mikroliterini tek bir tüpte birleştirin.
Karışımı bir pipet ve aliquot 10 mikrolitre karışımı dört ayrı tüp halinde homojenize edin. Tüpleri 30 santigrat derecede dört ila 18 saat kuluçkaya bırakın, ardından 65 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırarak enzimi ısı devre dışı bırakın. Isı inaktivasyonundan sonra, beş dakika boyunca 12 santigrat derecede inkübe ederek tüpün dibinde yoğuşma teşvik edin.
Daha sonra, her tüpe 15 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyerek elde edilen çözeltiyi seyreltin. DNA'yı daha önce gösterildiği gibi arındırmadan ve ölçmeden önce her tüpün içeriğini birleştirin. Hücresiz reaksiyonun gerçekleştirilmesi için, gerekli çeşitli bileşenleri bir tüpe ekleyin ve çift damıtılmış su ile son istenen hacme seyreltin.
Çözeltinin yarısını 10 ila 20 kez yukarı ve aşağı borulayarak çözeltiyi iyice karıştırın. Reaksiyon karışımını 15 mikroliter aliquots içinde mikrotiter plakada istenen kuyulara aktarın. Daha sonra nemi korumak ve buharlaşmayı önlemek için plakayı renksiz bir sızdırmazlık filmi ile kapatın.
Mühürlü plakayı plaka okuyucusunda yerleştirin ve reaksiyonun tamamlanmaya devam etmesine izin verin. Hücresiz sistemi kullanarak subtilisin BPN genini ifade ediyorsanız, düz tabanlı, renksiz 96 kuyu plakasında 94 mikrolitre çift damıtılmış su ve 10 mikromoler PNA'lık bir mikrolitre. Ardından, tamamlanan hücresiz reaksiyonun beş mikrolitresini ekleyin ve 25 santigrat derecelik bir sıcaklığı korurken 10 dakika boyunca her 20 saniyede bir 410 nanometrede emiciliği ölçmek için ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
BL21 DE3 yıldız özünde Superfolder GFP'nin 15 mikrolitre reaksiyonda sadece 3 mikrolitrelik amaçlanmamış RCA DNA'sı kullanılarak ifade edilerek ifade edilişleri PJL1 plazmid ile karşılaştırılabilir. Şablon miktarlarını ikiye katlamak ve üçe katlamak, şablonun reaksiyon başına 3 mikrolitrede zaten doymuş seviyelerini öneren belirgin bir fayda sunmuyor gibi görünüyor. Tersine, karıştırma gerinim hücresi ekstresini kullanırken RCA şablon miktarını artırmanın bir yararı olduğu görülmektedir.
Daha düşük sıcaklıklar veya daha uzun katlama süreleri gerektiren proteinler, tüm iş akışını tamamlamak için gereken süreyi etkiler. Örneğin, dört saatlik ifadeden sonra subtilisin test etmek başarısız bir sonuca yol açar, çünkü subtilisin olgunlaşması için dört saat yeterli değildir. Bununla birlikte, reaksiyonun 16 saate kadar devam etmesine izin vermek, tespit edilebilir subtilisin seviyelerine yol açar.
Bu protokolün maksimum verimlilikte çalışması için tüm bileşenlerin iyi karıştırılması gerekir. Bu yöntemleri izleyerek, sentetik olarak büyük bir protein adayı kütüphanesi oluşturulabilir ve daha sonra karakterizasyon için yeterli verimle ifade edilebilir. Bu yöntem, grubumuzun hücre özlerinde çalışabilen N C iki sensör geliştirmesinin yolunu açtı ve prototip proteini hızlı bir şekilde karakterize etmemizi sağladı.
Bu, yeni biyo katalizörlerin ve tedavilerin protein tasarımında daha hızlı ve akıllı bir şekilde yinelememizi sağlayacaktır.
