هذا البروتوكول مهم لأنه يفصل كيفية توليد كميات كبيرة من قالب الحمض النووي بسرعة لاستخدامها في ردود الفعل الخالية من الخلايا من جزء جين صغير تم تلقيه من منشأة توليف. يمكن أن يولد تضخيم الدائرة المتداول كميات كبيرة من الحمض النووي أسرع من الاستنساخ التقليدي. لذلك فإنه يدعم أعلى الإنتاجية تصميم بناء اختبار دورات التعلم من مكتبات الحمض النووي الاصطناعية.
يمكن أن يكون لهذه التقنيات تباين كبير متأصل للمستخدمين الجدد بسبب العديد من الخطوات والأحجام الصغيرة المطلوبة. وينبغي إيلاء اهتمام دقيق لهذه التقنية، والممارسة يجعل الكمال. للبدء، أضف جميع المكونات من مجموعة PCR في أنبوب PCR واحد.
ثم أضف ميكرولتر واحد من جزء الجينات التي أعيد إنفاقها. تجانس الخليط برفق عن طريق الدوامة على إعداد متوسط لمدة خمس إلى 10 ثوان. بعد برمجة thermocycler وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة ، تشغيل PCR.
عند الانتهاء من PCR، استخدم مجموعة تنظيف PCR لتنقية الحمض النووي من مزيج التفاعل. في أنبوب 1.5 ملليلتر، أضف المخزن المؤقت لربط الحمض النووي وعينة PCR بنسبة خمسة إلى واحد. نقل هذا الخليط إلى العمود تدور والطرد المركزي في 16، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.
تجاهل التدفق من خلال. أضف 200 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي إلى العمود واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. طرد العمود مرة أخرى وتجاهل التدفق من خلال.
غسل العمود مرة أخرى مع المخزن المؤقت غسل الحمض النووي، كما هو موضح. بعد التخلص من التدفق من الغسيل الثاني، قم بإزالة أي مخزن مؤقت متبقي عن طريق الطرد المركزي للعمود لمدة دقيقة إلى دقيقتين إضافيتين. ل elute الحمض النووي، نقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر.
ثم أضف 46 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى العمود. بعد حضانة لمدة دقيقة واحدة، جمع الحمض النووي في الأنبوب عن طريق الطرد المركزي. وقياس الحمض النووي المنقى باستخدام مطياف.
لهضم وتعميم الحمض النووي، والجمع بين خمسة ميكرولترات من العازلة رد الفعل اللازمة، 20 وحدة من إنزيم تقييد HindIII، و 45 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى في أنبوب PCR. باستخدام ماصة، تجانس بلطف هذا الخليط. ثم احتضانه في دراجة حرارية لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
بعد اكتمال الحضانة، تعمل الحرارة على تعطيل إنزيم HindIII عن طريق الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 80 درجة مئوية. ثم أضف خمسة ميكرولترات من مخزن T4 Ligase المؤقت و 800 وحدة من T4 Ligase إلى الحمض النووي المهضوم حديثا. بعد خلط بلطف مع ماصة، واحتضان الخليط لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية لأداء رد فعل التعميم.
بمجرد اكتمال رد الفعل ، قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR كما هو موضح سابقا. ثم تحديد الحمض النووي. لتنفيذ تضخيم الدائرة المتدحرجة، اجمع بين جميع مكونات التفاعل وميكرويتر واحد من قالب التعبير الدائري المنقى في أنبوب واحد.
تجانس الخليط مع ماصة وaliquot 10 ميكرولتر من الخليط في أربعة أنابيب منفصلة. احتضان الأنابيب في 30 درجة مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة، ثم تسخين تعطيل الانزيم عن طريق احتضان في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تعطيل الحرارة، شجع التكثيف في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الحضانة عند 12 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، تمييع الحل الناتج عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى كل أنبوب. الجمع بين محتويات كل أنبوب قبل تنقية وقياس الحمض النووي كما هو موضح سابقا. لأداء التفاعل الخالي من الخلايا، أضف المكونات المطلوبة المختلفة إلى أنبوب وتمييع إلى الحجم النهائي المطلوب مع الماء المقطر المزدوج.
خلط الحل تماما عن طريق pipetting نصف الحل صعودا وهبوطا 10 إلى 20 مرة. نقل خليط التفاعل في aliquots 15 ميكرولتر إلى الآبار المطلوبة في لوحة microtiter. ثم ختم لوحة مع فيلم ختم عديم اللون للحفاظ على الرطوبة ومنع التبخر.
ضع اللوحة المغلقة في قارئ اللوحة واسمح لرد الفعل بالمضي قدما حتى الاكتمال. إذا كان التعبير عن الجين BPN subtilisin باستخدام نظام خال من الخلايا، aliquot 94 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج وميكرويتر واحد من 10 ميكرومولار PNA في شقة القاع، عديم اللون 96 لوحة بئر. ثم أضف خمسة ميكرولترات من التفاعل المكتمل الخالي من الخلايا واقرأ اللوحة باستخدام قارئ لوحة تم ضبطه لقياس الامتصاص عند 410 نانومتر كل 20 ثانية لمدة 10 دقائق مع الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية.
التعبير عن GFP Superfolder في استخراج نجمة BL21 DE3 باستخدام 3 ميكرولترات فقط من الحمض النووي RCA غير المبورة في رد فعل 15 ميكرولتر مماثل لرد فعل PJL1 plasmid. مضاعفة وثلاثة أمثال كميات من قالب ويبدو أن لا تقدم أي فائدة واضحة ، مما يشير إلى مستويات مشبعة بالفعل من القالب في 3 ميكرولتر لكل رد فعل. على العكس من ذلك، يبدو أن هناك فائدة لزيادة كمية قالب RCA عند استخدام استخراج الخلية سلالة خلط ورق اللعب.
تؤثر البروتينات التي تتطلب درجات حرارة أقل أو أوقات طي أطول على الوقت اللازم لإكمال سير العمل بأكمله. على سبيل المثال، يؤدي اختبار subtilisin بعد أربع ساعات من التعبير إلى نتيجة فاشلة، حيث أن أربع ساعات ليست كافية لنضوج subtilisin. ومع ذلك ، فإن السماح لرد الفعل بالاستمرار إلى 16 ساعة يؤدي إلى مستويات يمكن اكتشافها من subtilisin.
يجب أن تكون جميع المكونات مختلطة بشكل جيد حتى يعمل هذا البروتوكول بأقصى قدر من الكفاءة. باتباع هذه الأساليب، يمكن إنشاء مكتبة كبيرة من المرشحين البروتين صناعيا ومن ثم أعرب في غلة كافية لتوصيف. مهدت هذه الطريقة الطريق لمجموعتنا لتطوير N C اثنين من أجهزة الاستشعار التي يمكن أن تعمل في مقتطفات الخلية، مما يسمح لنا لتوصيف بسرعة البروتين النموذج الأولي.
وهذا سيمكننا من التكرير بسرعة وذكاء أكبر على تصميم البروتين من المحفزات الحيوية الجديدة والعلاجات.
