Astrositlerin 3D biyobaskı, nörolojik hastalıkta yer alan mekanizmaları anlamak için yararlı olan in vitro modellerin biyofabrikasyonuna izin veren nöro doku mühendisliğinde bir ilerlemeyi temsil eder. 3D biyobaskılamanın temel avantajı, dokuların biyokimyasal ve mekanik özelliklerini taklit eden hücre yardımcı yapılarını biyofabrik haline getirmek, sağlık ve hastalıkta hücre dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamaktır. Bu protokol, doğal polimerler ve hücre dışı matris bileşenlerinden oluşan bir biyo-mürekkecin 3D biyobaskısına dayandığı için diğer yumuşak dokuların biyofabrikasyonuna uygulanabilir.
Başlangıç olarak, ötenazili fareden izole edilmiş kortikal dokuyu kavisli bir mikro makasla küçük parçalara bölün. Doku parçalarını yukarı ve aşağı pipetleme ile bir mililitre HBSS ile üç kez yıkayın. Üçüncü kez eklenen HBSS'yi çıkardıktan sonra, bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin ve dokuyu 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya bırakın.
Mekanik doku ayrışması için, doku tripsin karışımını 15 kez hafifçe pipetleyin. Daha sonra, ayrışmış karışımı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tripsin aktivitesini nötralize etmek için eşit miktarda FBS ekleyin. Ayrışmayan parçaları çıkarmak için süspansiyonu 0,4 mikrometre hücre süzgeç filtresinden geçirin.
Filtreyi bir mililitre astrosit ortamıyla yıkayın. Pelet, santrifüjleme ile filtrelenmiş hücre süspansiyonunu indirdi. Süpernatant attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre astrosit kültür ortamında askıya alın.
Hücre süspansiyonu bir T25 kültür şişesine aktarın. Toplam 3,5 mililitrelik orta hacmi oluşturan ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırarak. Mililitre başına üç miligramlık son konsantrasyonda fibrinojen elde etmek için, mililitre fibrinojen çözeltisi başına 10 miligramın 0,9 mililitresini jelatin-jelatin methacryloyl çözeltisine aktarın.
Fotoğraf başlatıcıyı hacme göre% 0,5 ağırlıkta son konsantrasyonda elde etmek için, hazırlanan jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen çözeltisine 0,015 gram fotoğraf başlatıcısı ekleyin. Girdaplamadan sonra, PI bozulmasını önlemek için çözeltiyi ışıktan korunarak 40 santigrat derecede tutun. Daha sonra, çözeltiyi 0,2 mikrometre filtreden steril 15 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin.
Biyomalzeme çözeltisinin 980 mikrolitresini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mililitre başına iki mikrogramın son konsantrasyonunda laminin elde etmek için, biyo-mürekkep içeren tüpe 20 mikrolitre seyreltilmiş laminin ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcıklardan kaçınarak hafifçe karıştırın ve biyo-mürekkep çözeltisini hücrelerle karışmaya hazır olana kadar 37 santigrat derecede tutun.
Birincil astrositleri 5 dakika boyunca %0,05 trypsin ile deneyin ve FPS ile tripsin aktivitesini bire bir oranında nötralize edin. Ardından, hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de 15 mililitrelik konik tüpe ve santrifüje aktarın. Hücreleri saydıktan sonra, 1 kez 10'u 6 hücreye, gösterildiği gibi farklı bir konik tüpe ve santrifüje aktarın.
Tüpte sadece 200 mikrolitre süpernatan bırakın ve konik tüpün altına hafifçe dokunarak hücre peletini askıya alın. Mililitre başına 6 hücreye 1 kez 10'luk son bir konsantrasyon elde etmek için, bir mililitre jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen çözeltisini hücreleri içeren tüpe aktarın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin. Jelatin-jelatin methacryloyl fibrinojen biyo-mürekkep çözeltisine yerleştirilmiş astrositleri yavaşça beş mililitre plastik şırıngaya aktarmak için 1000 mikrolitre pipet kullanın, kabarcık oluşumunu önler.
Steril 22 kalibrelik künt iğneyi şırıngaya bağlayın. Biyobaskıyı 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın ve ardından biyobaskıyı% 70 etanol ile silin, ardından şırınnayı biyobaskı baskı kafasına bağlayın ve kalan kabarcıkları çıkarmak için biyo mürekkeyi manuel olarak yıkayın. Biyobaskı yapmak için, biyobaskı masasına 35 milimetre kültür çanağına yerleştirin, iğnenin hareket etmesine izin vermek için iğneyi kültür çanağı yüzeyinden 0,1 milimetre uzağa yerleştirin ve Yazdır düğmesine basın.
Biyobaskı bittikten sonra şırınnanın yemekten ve yakın kültür çanağından uzaklaştığından emin olun. Jelatin methacryloyl çapraz bağlama için kültür çanağı UV ışığı altına yerleştirin. Biyobaskı yapıyı 24 kuyu plakasına aktarmak için steril bir spatula kullanın.
500 mikrolitre trombin kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin ve fibrin çapraz bağlanmasına izin vermek için 30 dakika bekletin. Çapraz bağlama çözeltisini çıkardıktan sonra, yapıyı iki mililitre PBS ile yıkayın, ardından PBS'yi bir mililitre astrosit kültür ortamıyla değiştirin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın ve ortamı her üç günde bir değiştirin.
Biyobaskı yapıyı 35 milimetrelik bir kültür çanağına aktarmak için bir spatula kullanın. Yapıyı bir mililitre PBS ile yıkayın. Canlı ölü reaktifin 100 mikrolitresini yapının üzerine yatırın ve ışıktan korunarak 37 santigrat derecede 30 dakika tutun.
Canlı ölü reaktifi çıkardıktan sonra, yapıyı gösterildiği gibi PBS ile yıkayın. Örneği bir konfokal çanağa aktarın ve görüntü elde etmek için 488 ve 570 nanometre uyarım kullanarak konfokal mikroskop altında yapı içindeki hücreleri gözlemleyin. 3D biyobaskıdan sonra, biyobaskılı iskelenin bütünlüğü tahmin edildi ve biyomalzeme içinde yer alan hücrelerle iyi tanımlanmış bir yapının oluşumu gözlendi.
Biyobaskı ve çapraz bağlama işlemlerinden sonra, yapı bir astrosit ortamı ile inkübe edildiğinde çoğu hücre yuvarlak morfoloji sundu. Biyobaskılı iskeleler yedi günlük inkübasyondan sonra bütünlüğünü korudu ve bazı yuvarlak hücreler gözlenmesine rağmen, birçok astrosit yapı boyunca yayıldı ve astrositik morfoloji ve ara bağlantı sundu. Hücre canlılığı biyobaskıdan hemen sonra değerlendirildi ve sonuçlar, daha düşük hızda, canlı hücrelerin toplam hücrelerin% 74'üne kadar temsil ettiğini ve daha yüksek hızda biyobaskıda olan hücrelerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi.
Biyobaskılı astrositlerin uygulanabilirliği 2D kültürlü astrositlere normalleştirildi ve sonuçlar yedinci günde biyobaskı astrositlerinin canlılığını önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Biyobaskıdan hemen sonra, astrositler yuvarlak morfoloji gösterdi ve ölü testlerle yaşadılar. Bir hafta sonra, astrositler yapıya yayıldı ve 2D kültürüne benzer farklı bir hücre morfolojisi sundu.
3D biyobaskı astrositleri immünoforeziksiyon ile karakterize edildi. Biyobaskı yapısında yedi günlük inkübasyondan sonra, yıldız benzeri morfolojiye sahip oldukça yoğun astrositler gözlendi. Biyobaskılı astrosit hücreleri, yedi günlük biyobaskıdan sonra astrosit fenotipinin korunmasını gösteren spesifik astrosit belirteci glial fibril asidik proteini ifade etti ve bu sonuçlar biyo-mürekkep bileşiminin astrositlerin yapışıklığını, yayılmasını ve büyümesini teşvik etmek için biyouyumlu bir mikroçevre sağladığını göstermektedir.
Biyobaskılı astrositler tarafından belirli genlerin ve hücre belirteçlerinin ekspresyonunun değerlendirilmesi, belirli uyaranları takip eden astrositary reaktivitesi gibi nöro doku benzeri fonksiyonun kanıtını sağlayacaktır. Bu protokol, biyomoleküllerdeki farklı hücre türlerinden oluşan daha karmaşık nöro benzeri yapıların biyofabrikasyonuna zemin hazırlayarak belirli nörojenik nişlerin taklitini sağlar.
