星形胶质细胞的3D生物打印代表了神经组织工程的进步，允许生物制造体外模型，这些模型有助于理解神经系统疾病所涉及的机制。3D生物打印的主要优点是生物制造模拟组织生化和机械特征的细胞辅助结构，从而更好地了解健康和疾病中的细胞动力学。该协议可应用于其他软组织的生物制造，因为它基于由天然聚合物和细胞外基质组分组成的生物墨水的3D生物打印。
首先，用弯曲的微型剪刀将从安乐死小鼠中分离出来的皮质组织切成小块。通过上下移液，用一毫升HBSS清洗组织块三次。第三次取出添加的HBSS后，加入一毫升0.05%胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育组织五分钟。
对于机械组织解离，轻轻地上下移液组织胰蛋白酶混合物15次。接下来，将解离的混合物转移到15毫升锥形管中，并加入等体积的FBS以中和胰蛋白酶活性。通过0.4微米细胞过滤器过滤悬浮液以除去未解离的片段。
用一毫升星形胶质细胞培养基洗涤过滤器。通过离心将沉淀下来过滤后的细胞悬浮液。弃去上清液后，将细胞沉淀悬浮在一毫升星形胶质细胞培养基中。
将细胞悬浮液转移到T25培养瓶中。构成3.5毫升的总培养基体积，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育细胞。为了获得终浓度为每毫升3毫克的纤维蛋白原，将0.9毫升每毫升10毫克的纤维蛋白原溶液转移到明胶 - 明胶甲基丙烯酰溶液中。
为了获得终浓度为0.5%重量体积的光引发剂，向制备的明胶-明胶甲基丙烯酰纤维蛋白原溶液中加入0.015克光引发剂。涡旋后，将溶液保持在40摄氏度，避光，避免PI降解。接下来，通过0.2微米过滤器过滤溶液到无菌的15毫升锥形管中。
将980微升的生物材料溶液转移到15毫升的锥形管中。为了获得最终浓度为每毫升2微克的层粘连蛋白，将20微升稀释的层粘连蛋白加入含有生物墨水的管中。通过上下移液轻轻混合，避免气泡，并将生物墨水溶液保持在37摄氏度，直到准备好与细胞混合。
用0.05%胰蛋白酶对原代星形胶质细胞进行胰蛋白酶消化5分钟，并用FPS以一比一的比例中和胰蛋白酶活性。然后，将细胞转移到15毫升的锥形管中，并以200倍G离心5分钟。计数细胞后，将1次10到6个细胞转移到不同的锥形管中并离心，如图所示。
在管中仅留下200微升的上清液，并通过轻轻敲击锥形管的底部来悬浮细胞沉淀。为了获得每毫升10至6个细胞的1倍的最终浓度，将一毫升明胶 - 明胶甲基丙烯酰纤维蛋白原溶液转移到含有细胞的管中，并通过轻轻地上下移液来均质化。使用1000微升移液器将明胶 - 明胶甲基丙烯酰纤维蛋白原生物墨水溶液中铺设的星形胶质细胞缓慢转移到五毫升塑料注射器中，避免形成气泡。
将无菌的22号钝针连接到注射器。将生物打印机暴露在紫外线下15分钟，然后用70%乙醇擦拭生物打印机，然后将注射器连接到生物打印机打印头并手动冲洗生物墨水以除去剩余的气泡。要进行生物打印，请将培养皿放置在生物打印机台上的35毫米培养皿中，将针头放置在距离培养皿表面0.1毫米的位置以允许针头移动，然后按下打印"按钮。
生物打印结束后，确保注射器远离培养皿并关闭培养皿。将培养皿置于紫外光下，使明胶甲基丙烯酰交联。使用无菌刮刀将生物打印的构建体转移到24孔板中。
加入500微升凝血酶氯化钙溶液，静置30分钟，让纤维蛋白交联。除去交联溶液后，用两毫升PBS洗涤结构，然后用一毫升星形胶质细胞培养基代替PBS。在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育，每三天更换一次培养基。
使用刮刀将生物打印的构建体转移到35毫米培养皿中。用一毫升PBS清洗结构。将100微升活死试剂沉积在结构物上，并将其保持在37摄氏度下30分钟，使其免受光照。
取出活死试剂后，如图所示用PBS清洗构建体。将样品转移到共聚焦培养皿中，并在共聚焦显微镜下使用488和570纳米激发观察构建体内的细胞以进行图像采集。在3D生物打印之后，估计了生物打印支架的完整性，并观察到细胞被捕获在生物材料内的明确结构的形成。
在生物打印和交联过程之后，当构建体与星形胶质细胞培养基孵育时，大多数细胞呈现圆形形态。生物打印的支架在孵育七天后保持完整性，尽管观察到一些圆形细胞，但许多星形胶质细胞在整个结构中扩散，呈现星形细胞形态和相互连接。在生物打印后立即评估了细胞活力，结果表明，在较低的速度下，活细胞占总细胞的74%，明显高于以较高速度生物打印的细胞。
生物打印星形胶质细胞的活力归一化为2D培养的星形胶质细胞，结果表明，在第七天，生物打印的星形胶质细胞的活力显着增加。生物打印后，星形胶质细胞立即显示出圆形形态和活死测定。一周后，星形胶质细胞扩散到整个构建体中，并呈现出与2D培养物相同的细胞的独特形态。
3D生物打印星形胶质细胞通过免疫荧光进行表征.在生物打印结构中孵育七天后，观察到具有星状形态的高致密星形胶质细胞。生物打印的星形胶质细胞表达的特异性星形胶质细胞标志物神经胶质原纤维酸性蛋白表明经过生物打印7天后星形胶质细胞表型的保留，这些结果表明，生物墨水组合物提供了一种生物相容的微环境，以促进星形胶质细胞的粘附、扩散和生长。
生物打印的星形胶质细胞对特定基因和细胞标记表达的评估将为神经组织样功能提供证据，例如特定刺激后的星形胶质细胞反应性。该协议为生物分子中由不同类型的细胞组成的更复杂的神经样结构的生物制造铺平了道路，从而允许模仿特定的神经源性生态位。
