3D-биопечать астроцитов представляет собой прогресс в нейротканевой инженерии, позволяя биофабрикацию моделей in vitro, которые полезны для понимания механизмов, участвующих в неврологических заболеваниях. Основным преимуществом 3D-биопечати является биофабрикат клеточных вспомогательных структур, которые имитируют биохимические и механические особенности тканей, обеспечивая лучшее понимание динамики клеток в здоровье и болезни. Этот протокол может быть применен к биофабрикации других мягких тканей, так как он основан на 3D-биопечати био-чернил, состоящих из природных полимеров и компонентов внеклеточного матрикса.
Для начала разрежьте кортикальные ткани, выделенные от усыпленной мыши, на мелкие кусочки изогнутыми микронарезами. Промыть кусочки ткани три раза одним миллилитром HBSS путем пипетки вверх и вниз. После удаления HBSS добавляют в третий раз, добавляют один миллилитр 0,05% трипсина и инкубируют ткань в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.
При механической диссоциации тканей аккуратно пипеткой смесь трипсина тканей вверх и вниз 15 раз. Затем переложите диссоциированную смесь в коническую трубку объемом 15 миллилитров и добавьте равный объем FBS для нейтрализации активности трипсина. Отфильтруйте суспензию через 0,4-микрометровый фильтр клеточного сетчатого фильтра для удаления недиссоциированных фрагментов.
Промыть фильтр одним миллилитром среды астроцитов. Гранулировать фильтрованную клеточную суспензию центрифугированием. После выброса супернатанта суспендируют клеточную гранулу в одном миллилитре культурального носителя астроцитов.
Переложите клеточную суспензию в колбу для культуры Т25. Составьте общий объем среды 3,5 миллилитра и инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Для получения фибриногена в конечной концентрации три миллиграмма на миллилитр переложите 0,9 миллилитра по 10 миллиграммов на миллилитр раствора фибриногена в желатино-желатиновый метанрилоиловый раствор.
Для получения фотоинициатора в конечной концентрации 0,5% массы по объему добавляют 0,015 г фотоинициатора к приготовленному желатино-желатиновой метакрилоилфабриногену. После вихря держите раствор при 40 градусах Цельсия, защищенный от света, чтобы избежать деградации PI. Затем отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 микрометра в стерильную коническую трубку размером 15 миллилитров.
Переложите 980 микролитров раствора биоматериала в коническую трубку размером 15 миллилитров. Для получения ламинина в конечной концентрации двух микрограммов на миллилитр добавляют 20 микролитров разбавленного ламинина в пробирку, содержащую биочерна. Осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, избегая пузырьков, и держите раствор био-чернил при 37 градусах Цельсия до готовности к смешиванию с клетками.
Трипсинизируют первичные астроциты с 0,05% трипсина в течение 5 минут и нейтрализуют активность трипсина с FPS в соотношении один к одному. Затем перенесите клетки в коническую трубку 15 миллилитров и центрифугу в 200 раз G в течение пяти минут. После подсчета клеток переложите 1 раз 10 на 6 клеток в другую коническую трубку и центрифугу, как показано на демонстрации.
Оставьте только 200 микролитров супернатанта в трубке и подвешивайте гранулу ячейки, осторожно постукивая по дну конической трубки. Для получения конечной концентрации от 1 раза 10 до 6 клеток на миллилитр перенесите один миллилитр желатино-желатинового метанрилоилфабриногена в трубку, содержащую клетки, и гомогенизируйте путем осторожной пипетки вверх и вниз. Используйте пипетку 1000 микролитров для медленного переноса астроцитов, уложенных в желатино-желатиновый раствор биочернил фибриногена, в пятимиллилитровой пластиковый шприц, избегая образования пузырьков.
Подключите к шприцеву стерильную тупую иглу 22 калибра. Подвергайте биопринтер воздействию ультрафиолетового излучения в течение 15 минут, а затем протрите биопринтер 70% этанолом, затем подключите шприц к печатающей головке биопринтера и вручную промойте биочернаки, чтобы удалить оставшиеся пузырьки. Для проведения биопечати поместите на 35-миллиметровую культурную тарелку на стол биопринтера, расположите иглу на 0,1 миллиметра от поверхности чашки для культивирования, чтобы обеспечить движение иглы, и нажмите кнопку «Печать».
Как только биопечать закончится, убедитесь, что шприц отходит от тарелки и закрывает чашку для культуры. Поместите культурную посуду под ультрафиолетовый свет для сшивания желатина метакрилоила. Используйте стерильный шпатель для переноса биопечатной конструкции на пластину из 24 скважин.
Добавьте 500 микролитров раствора тромбина кальция хлорида и оставьте на 30 минут, чтобы фибрин сросся. После удаления сшивающего раствора промыть конструкцию двумя миллилитрами PBS, затем заменить PBS одним миллилитром культурального среды астроцитов. Инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа и меняют среду каждые три дня.
Используйте шпатель, чтобы перенести биопечатную конструкцию на 35-миллиметровую культурную чашку. Вымойте конструкцию одним миллилитром PBS. Нанесите 100 микролитров живого мертвого реагента на конструкцию и держите его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, сохраняя его защищенным от света.
После удаления живого мертвого реагента промыте конструкцию PBS, как показано на продемонстрированной. Перенесите образец на конфокальную тарелку и наблюдайте за клетками внутри конструкции под конфокальным микроскопом, используя возбуждение 488 и 570 нанометров для получения изображения. После 3D-биопечати была оценена целостность биопечатного каркаса и наблюдалось формирование четко определенной структуры с клетками, попав в ловушку биоматериала.
После биопечати и процессов сшивания большинство клеток представляли круглую морфологию, когда конструкт инкубировали с астроцитарной средой. Биопечатные каркасы сохраняли целостность после семи дней инкубации, и хотя наблюдались некоторые круглые клетки, многие астроциты распространялись по всей конструкции, представляя астроцитическую морфологию и взаимосвязь. Жизнеспособность клеток оценивалась сразу после биопечати, и результаты показали, что при более низкой скорости жизнеспособные клетки составляли до 74% от общего количества клеток, будучи значительно выше, чем клетки, биопечатанные на более высокой скорости.
Жизнеспособность биопечатных астроцитов была нормализована до 2D культивируемых астроцитов, и результаты показали, что на седьмой день биопечатные астроциты значительно увеличили жизнеспособность. Сразу после биопечати астроциты показали круглую морфологию и живой мертвый анализ. Через неделю астроциты распространились по всей конструкции и представили отчетливую морфологию клеток, идентичную 2D-культуре.
3D-биопечатные астроциты характеризовались иммунофлуоресценцией. После семи дней инкубации в биопечатной конструкции наблюдались высокоплотные астроциты со звездоподобной морфологией. Биопечатные клетки астроцитов, экспрессирующие специфический маркер астроцитов глиального фибриллярного кислого белка, указывает на сохранение астроцитарного фенотипа после семи дней биопечати, и эти результаты указывают на то, что композиция биочернил обеспечила биосовместимую микросреду для содействия адгезии, распространению и росту астроцитов.
Оценка экспрессии специфических генов и клеточных маркеров биопечатными астроцитами обеспечит доказательства нейротканевой функции, такой как астроцитарно-реактивность после специфических стимулов. Этот протокол прокладывает путь для биофабрикации более сложных нейро-подобных структур, состоящих из различных типов клеток в биомолекулах, позволяя имитировать конкретные нейрогенные ниши.
