Zebra balığı ksinograftları kanser araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsan tümör hücrelerini alıp küçük larva zebra balıklarına, hatta yetişkinlere enjekte edebilirsiniz. Burada, sunduğumuz şey, canlı bir hayvanda birkaç insan kanseri ayırt edici özelliklerini inceleyebileceğimiz larva modelinin adım adım protokolüdür.
Çoğalma, anjiogenez, metastaz ve ayrıca tümör mikroçevrim içindeki etkileşimleri inceleyebilirsiniz. Ve büyük bir avantaj, bunu çok kısa bir zaman diliminde inceleyebilebilebilenizdir. Mesela sadece dört gün.
Bir başka büyük avantaj, bir konfokal veya ışık sayfası mikroskobu kullanarak bu canlıyı tek hücre çözünürlüğüyle inceleyebilmenizdir. Hücrelerin nasıl göç ettiklerini, hücrelerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini ve hatta birbirleriyle nasıl konuştuklarını inceleyebilirsiniz. Yani kanser biyolojisi okumak için gerçekten güçlü bir model.
Zebra balığı ksinograftları, kemoterapi, radyoterapi ve hatta antikorlarla hedeflenen tedaviler gibi kanser önleyici tedavilere yanıt çalışmak için kullanılabilir. Ve son olarak, bu protokol cerrahi bir örnekten, hatta biyopsilerden hasta kaynaklı hücreleri kullanmak ve daha sonra zebra balığı avatarlarını oluşturmak için de uyarlanabilir. Enjeksiyon için hazırlanıyoruz.
Enjeksiyondan iki hafta önce, kültürdeki hücreleri genişletin. Eğitim sırasında birçok hücre ve balık kaybolacağından, teknikle yetkin hale gelene kadar fazla hücreler ve fazla balıklarla başlayın. Tablo 1, eşlik eden PDF'nin birkaç hücre hattının enjeksiyonu için en uygun in-vitro izdiham yüzdelerinin ayrıntılı bir kılavuzuna sahiptir.
Enjeksiyondan üç gün önce, istenen arka planın zebra balıklarını geçin. Enjeksiyondan 24 saat önce. Zebra balığı embriyo plakalarını temizleyin.
Tüm ölü ve gelişmemiş embriyoları atın ve E3 ortamını yenileyin. Hücre kültürü odasında, hücre kültürü ortamını atın. Ölü hücreleri çıkarmak ve taze ortam eklemek için PBS 1X ile bir kez yıkayın.
Embriyoları enjeksiyon için hizalamak için mikroenjeksiyon iğneleri, agarose plakaları ve saç tokaları gibi enjeksiyon prosedürü için araçları hazırlayın. Plaka hazırlığı için, temiz bir Petri kabının kapağına bir tabaka çözünmüş% 2 agarose dökün. Polimerize olmasına izin verin ve bir cetvel yardımıyla embriyoların hizalanması için üç ila dört düz agarose çizgisi yapın.
Enjeksiyon günü. Yumurtadan çıkan embriyoları unhatched yumurtalardan ayırın. Bu aşamada embriyo ortamına Pronaz eklenmesi kuluçkayı artırabilir.
Embriyoları enjeksiyona kadar 28 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Enjeksiyon için hücre etiketlemesi. Tekrarlanabilir bir hücre etiketleme tekniğinin oluşturulmasına yardımcı olmak için, hücre satırlarının listesinin ve birkaç etiketleme çözümünün derlenmesi için yazılı protokolün bir ve iki tablolarını denetleyin.
Hücre kültürü ortamını çıkarın ve şişeyi PBS 1X ile iki kez yıkayın. Hücreleri lipofilik bir boya ile etiketleyerek ışığa maruz kalmaktan kaçının ve şişeyi 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ayrıca, hücreleri ayırma üzerine 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünde etiketlemeyi de seçebilirsiniz.
Hücre etiketleme solüsyonını çıkarın ve fazla boyayı çıkarmak için hücreleri PBS 1X ile yıkayın. İlgili ayırma maddesini ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Şişeyi steril bir hücre kazıyıcı ile fırçalayarak ayırma işlemini kolaylaştırın ve hücreleri serolojik bir pipetle toplayın.
Hücreleri 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerine ve santrifüje aktarın. Süpernatant atın ve peletin hücre kültürü ortamı ile yeniden askıya alın. Trypan mavi dışlama veya başka bir tercih yöntemi ile bir Neubauer odası kullanarak hücre canlılığını ölçün.
Enjeksiyon ortamındaki hücreleri santrifüjle ve yeniden askıya alın. Orta boyda önerilen hücre konsantrasyonları makalenin bir tablosunda bulunabilir. Bu noktadan sonra hücreler buzda tutulmalıdır.
Enjeksiyon prosedürleri. Embriyoları trikain 1X'te 5 dakika uyuşturun. Daha sonra, az miktarda uyuşturularak embriyoları bir agarose plakasına aktarın ve bir saç tokası döngüsü yardımıyla hizalayın.
Embriyolar arasındaki mesafeyi koruduğunuzdan emin olun. Özellikle birinin sarısı ile bir sonrakinin başı arasında. Mortaliteyi önlemek için, plakaya bir ila üç damla trikain 1X çözeltisi dikkatlice ekleyerek hizalanmış embriyoların agarose plakasında kurumamasını sağlayın.
Hücreleri yeniden askıya almak için mikrosantrifüj tüpüne hafifçe dokunun. Enjeksiyon iğnesini bir Mikro doldurucu ucu kullanarak bir hücre süspansiyonu ile geri yükleyin, embriyoların bütünlüğünü tehlikeye atabilecekleri için hava kabarcıklarından kaçının. Hava basıncı vanasını açın, mikroenjektörü kurun ve mikroenjeksiyon iğnesini dikkatlice tutucuya yerleştirin.
Mikroenjeksiyon iğnesini ucuna yakın kesin. Embriyonun sarısını dikkatlice delin, iğnenin açısını düşürün ve iğnenin ucu perivitelline uzayına ulaşana kadar dikkatlice itin. Uç perivitelline alanına girdikten sonra hücrelere enjekte edin.
Kardiyak ödemi önlemek için embriyonun gözünün büyüklüğüne ve kalpten mümkün olduğunca uzak bir hücre hacmi enjekte etmeye çalışın. Gerekirse mikroenjektör basıncını ayarlayın. Enjekte edilen embriyoları trikain 1X çözeltili temiz bir Petri kabına aktarın ve beş ila 10 dakika dinlenmeye bırakın.
Bu yaranın kapanması için zaman verecektir. Trikain 1X çözeltisini çıkarın ve taze E3 ortamı ekleyin. Daha sonra embriyoları 34 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Bu sıcaklık hem zebra balığı embriyolarının hem de insan tümör hücrelerinin hayatta kalmasını sağlayacaktır. Metastatik test. Hücre hatlarınızın metastatik potansiyelini incelemek istiyorsanız, enjeksiyondan yaklaşık bir saat sonra, enjekte edilen embriyoları floresan stereomikroskop üzerinde tarayın ve dolaşımdaki kanser hücrelerinin yokluğuna veya varlığına göre iki gruba ayırın.
Enjeksiyondan sonra bir gün. Floresan stereomikroskopta, her embriyoyu dikkatlice analiz edin ve uygun şekilde enjekte edilmiş tümörleri olanları seçin. Seçilen ksinograftları tümör büyüklüğüne göre sıralayın.
Karşılaştırma için gözün boyutunu kullanın. Anormal morfoloji, kardiyak veya yumurta sarısı ödemi olan embriyoları, çok az kanser hücresine sahip ksinograftları veya sadece yumurta sarısının içinde kanser hücresi olanları atın. Ksinograftları istenen deneysel düzene göre dağıtın ve ilaç testini başlatın.
İlaçları ve E3 ortamını günlük olarak değiştirin. Xenograft'ları kuluçkaya yatırarak, tahlil sonuna kadar 34 santigrat derecelik sıcaklığı koruyun. Enjeksiyondan dört gün sonra.
Tahlilin son gününde, ksinograftları trikain 1X çözeltisi ile uyuşturun ve agar plakasına dikkatlice hizalayın. Ölü veya şişmiş ksinograftları atın. Bu ksinograftlar gravür nicelleştirme için dikkate alınmaz.
Floresan stereomikroskopta, her bir ksinograftı dikkatlice analiz edin ve perivitellin alanında tümörlerin yokluğunu veya varlığını değerlendirin. Deneysel kuruluma göre, ilgi çekici ksinograftları seçin ve trikain 25X ile ötenazi. İmmünasyona devam etmek için oda sıcaklığında en az 4 saat boyunca% 4 formaldehit içinde sabitlayın.
Aksi takdirde, gece boyunca dört santigrat derecede saklayın ve ertesi gün formaldehiti% 100 metanol ile değiştirin. %100 metanolde sabitlenmiş kinograftlar süresiz olarak 20 derecede saklanabilir. Konfokal görüntüleme için tüm montaj immünostaining.
Tüm montaj immünofluoresans tekniği aşağıdaki gibi bölünmüş olarak üç gün sürer. İlk gün ksinograftların permeabilizasyonu ve primer antikor inkübasyonu içindir. İkinci gün, yıkama ve ikincil antikor inkübasyonu için.
Ve üçüncü gün, yıkama, ksinograftların sabitlenmesi ve montaj ortamında depolama için. Bu prosedürün daha fazla ayrıntısını eşlik eden PDF'de bulabilirsiniz. Ksinograftların montajı.
Montaj ortamının sızmaması için bir kapak fişinin kenarlarını petrol jölesi veya silikon gresle kapatın. Pasteur pipet kullanarak ksinograftları kapak fişine aktarın. Onları dikkatlice bir saç tokası ile hizalayın.
Montaj ortamını başka bir kapak fişine ekleyin. Her iki kapak fişini de dikkatlice birleştirin ve daha kolay manipülasyon sağlamak için bir mikroskop slaydının üzerine yerleştirin. Konfokal görüntüleme.
Su düzeltmeli apokromatik 25X daldırma objektif lens, tümörleri tek bir hücre çözünürlüğü ile görüntülemek için en uygunudur. Her dilim arasında beş mikronluk bir aralıkla Z-Stack işlevini kullanarak örnekleri alın. Ham verileri Fiji yazılımında açın.
Ksenograft başına z-yığını başına üst, orta ve alttan tümörün üç temsili dilimini seçin. Fiji yazılımından Hücre Sayacı eklentisini açın. Hücre Sayacı aracında Başlat'ı tıklatın, bir sayaç türü seçin ve sayım modunu el ile başlatmak için resmi tıklatın.
Her tıklama için sayaç kaç hücrenin sayılacağını sorar. Tümördeki toplam hücre sayısını elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın. Bağışıklık hücreleri, mitotik figürler, aktif kaspaz gibi toplam sayıları veya işaretleyicilerin yüzdesini değerlendirmek için, hücre sayacı eklentisi ile z-yığınının tüm dilimleri boyunca belirli etiketleme, işaretleyici veya ilgi alanına olumlu olan hücreleri manuel olarak ölçün.
Bazı hücrelerin iki dilim arasında bulunacağını unutmayın. Hiçbir hücrenin iki kez sayılmamasını sağlamak için z yığınında ileri geri gidin. Temsili sonuçlar.
Protokolde açıklandığı gibi HCT 116 kolorektal kanser hücre hattı ksinograftları oluşturulmuştır. Ksinograftlar tedavi edilmeyen kontrollerde ve FOLFIRI kemoterapisinde rastgele dağıtıldı. Nükleik karşıtlık için anti-cleaved caspase-3 antikoru ve DAPI kullanılarak apoptotik hücreleri tespit etmek için immünoresans yapıldı.
Mitotik indeks, apoptoz ve tümör büyüklüğünün nicelleştirilmesi, FOLFIRI'nin tümör büyüklüğünün% 54 azalması eşliğinde mitozun önemli bir azalmasına ve apoptozun önemli bir indüksiyonuna neden olduğunu ortaya koydu. Bu özellikler, yüksek verimli fenotipik ilaç ekranlarında ve ayrıca birkaç kanser tedavisinin hücre içsel ve fizyolojik etkilerini kısa bir zaman diliminde test etmek için yararlıdır. Zebra balığı ksinograft modelinin bir başka büyük avantajı, farklı tümör hücrelerinin etkileşimlerini incelemek ve her hücre türünün diğerinin davranışını nasıl etkileyebileceğini analiz etmek mümkündür.
Farklı insan kanser hücreleri, aynı tümörden veya farklı tümörlerden farklı klonlar birlikte enjekte edilebilir. Bu örnekte, aynı hastadan elde edilen iki kolorektal kanser hücre hattı farklı lipofilik boyalarla etiketlenmiş ve enjeksiyon için bire bir oranında karıştırılmıştır. Bu protokolün araştırmacıların zebra balığı ksinograftları üretmede gerçek uzman olmalarına yardımcı olabileceğini umuyoruz.
Hiç kolay değil. Pratik yapman, pratik yapman gerekiyor. Sakın pes etme.
Oraya varacağına eminim. İyi şanslar.
