Elektroantennografi için, sivrisinekleri spesifik ve tutarlı bir fizyolojik durumda kullanmak, güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Adım adım protokol, sivrisineklerde kalıcı elektroantennografik kayıtlara izin verir. Yöntem, çeşitli sivrisinek türlerinde ve hem erkeklerde hem de kadınlarda kullanılabilir.
Elektroantennografik teknik, böcekler, sinekler, öpücük böcekleri ve karıncalar dahil olmak üzere diğer böcek modellerine de aktarılabilir. Başlamak için, koku verici karışımları ve bir çözücü kontrolü içeren 1,5 mililitrelik kehribar şişelerini, bozulmayı önlemek için saklandıkları 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Ardından, 10 mikrolitre koku verici çözeltiyi etiketli bir cam şırınganın içine yüklenmiş bir filtre kağıdı parçasına pipetin.
Deney gününde sivrisinekleri izole edin. Mikroskop altında çalışırken, bir çift forseps kullanarak iki borosilikat kılcal damarının ucunu filamentlerle hafifçe kırın. Elektroantennografiyi veya EAG deneyini çalıştırmadan önce, elektrot tutucularının borosilikat döküntüsü olmadan içeride temiz olduğundan emin olun.
Daha sonra, elektrot tutucuların gümüş tellerini, teller koyulaşana kadar, mat griye dönene kadar beş dakika boyunca saf ağartıcıya batırarak kloridizasyon yapın. Sonra telleri durulayın. Kauçuk tıpayı gevşetin ve kılcal damarın içini tuzlu su çözeltisiyle doldurmak için 20 gauge iğne kullanın.
Kılcal damarları durulayın ve telleri iki kılcal damara yerleştirin. Telin ucunu kılcal damarın ucundan bir milimetreden daha az tutun. Kılcal damarı elektrot tutucunun içindeki kauçuk halkadan kırmadan geçirin ve hava kabarcığı olmadığını doğruladıktan sonra kauçuk tıpayı hafifçe sıkın.
Kılcal damarı, referans elektrot tutucusundaki daha geniş açıklık ve kayıt elektrodu tutucusundaki daha küçük açıklıkla kullanın. Kafayı monte etmeye hazır olana kadar ucun kurumasını önlemek için monte edilmiş iki elektrot tutucuyu ıslak temizleme mendili üzerinde bırakın. Hava tablasının açık olduğundan emin olun.
Havayolunda tıkanıklık yok ve hava açık. Deneyin ortasında değiştirmekten kaçınmak için tıbbi hava deposunun dolu olduğunu doğrulayın ve nemlendiricideki kabarcıkları onaylayın. Bilgisayarları, yazılım uygulamalarını ve valf güç kaynağını açın.
İnternet bağlantısını doğruladıktan sonra, darbeleri ileten valfin işlevsel olduğunu doğrulamak için bir kontrol darbesi iletin. Bir parça ıslak temizleme mendili ile buzun üzerine alüminyum bir plaka yerleştirin ve bir köşeye küçük bir elektrot jeli koyun. Sivrisinek soğumasını sağlamak için buzun üzerine bir sivrisinek kabı yerleştirin.
Sivrisinek her anteninin ucunu mikro makasla kırpın. Elektrot jeli dollopunun yanındaki sivrisineği sürüklemek için forseps kullanın ve her antenin ucunu yavaşça jelin içine batırın. Forseps kullanarak, sivrisinek antenlerini yan yana tutarken dışarı çekin.
Mikro makas kullanarak sivrisinek kafasını doğrayın. Referans elektrodunun ucunu yavaşça jelin içine batırın ve başın ona yapışmasına izin vererek boyunla temas ettirin. Referans kafası elektrodunu bir mikro manipülatöre yerleştirin.
Her iki elektrot tutucuyu da amplifikatöre bağlayın. Kayıt elektrodunu anten uçlarına mümkün olduğunca yakın yerleştirmek için mikro manipülatörü kullanın. Ardından anten uçlarını kayıt elektroduna yerleştirin.
Havayolu borusunu sivrisinek kafası preparasyonuna yakın, bir santimetreye yerleştirin. Amplifikatörü ve gürültü azaltıcıyı açın ve taban çizgisi sinyalinin gürültülü olmadığından emin olun. Gürültü seviyesi tatmin edici olduğunda, testi gerçekleştirmek ve Faraday kafesini kapatmak için ilk koku şırıngasını havayolu deliğine yerleştirin.
Ardından, nabzı iletmek için EAG yazılımına kaydet'e tıklayın. EAG yanıtlarını milivolt cinsinden genlik olarak ölçün ve ardından bir sonraki koku veya konsantrasyonla devam edin. Deney, sivrisinek türlerinin farklı kimyasallara karşı değişken koku alma tepkileri gösterebileceğini başarıyla göstermektedir.
Negatif kontrol olarak kullanılan mineral yağa yanıt yoktu. Elektriksel gürültüden kaynaklanan sonuçlardaki hata, timsah klipsleri kullanılarak elemanların Faraday kafesine topraklanmasıyla azaltılabilir. Aynı koku vericiye tepki eşiği, farklı sivrisinek türleri için büyüklük olarak değişebilir.
Örneğin, Toxorhynchites rutilus septentrionalis sivrisinekleri, Aedes aegypti, Anopheles stephensi ve Culex quinquefasciatus ile karşılaştırıldığında çok büyük EAG'ler üretir. Pozitif kontrole yanıt olarak büyük bir sapma, benzaldehit, fark edildi. Negatif kontrole cevap eksikliği olsa da, mineral yağ.
Bu ortalama anten tepkileri bir çubuk diyagramında gösterilmiştir. Ek olarak, her sivrisinek türü için belirli bir kimyasalı tespit etme eşiği, anteni, kimyasalın artan konsantrasyonlarını sunarak ve bir doz tepki eğrisi çizerek belirlendi. Hazırlığın mükemmel bir şekilde yanıt vermesini sağlamak için kafa doğrandıktan ve monte edildikten sonra kayda mümkün olan en kısa sürede başlamak önemlidir.
EAG, sivrisinek antenlerinin belirli bir konsantrasyonda belirli bir kimyasala cevap verip vermediğini belirlemeye izin verir. Bununla birlikte, bu kimyasalın dengesini belirlemeye izin vermez. Örneğin, bir cezbedici mi yoksa tövbe mi olduğu.
