Para a eletroantenografia, o uso de mosquitos em um estado fisiológico específico e consistente é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis. O protocolo passo-a-passo permite registros eletroantenográficos duradouros em mosquitos. O método pode ser usado em várias espécies de mosquitos, e em machos e fêmeas.
A técnica eletroantennográfica também pode ser transposta para outros modelos de insetos, incluindo besouros, moscas, barbeiros e formigas. Para começar, remova os frascos de âmbar de 1,5 mililitro contendo as misturas de odorantes e um controle de solvente do freezer de 20 graus Celsius em que eles são armazenados para evitar a degradação. Em seguida, pipetar 10 microlitros da solução odorante para um pedaço de papel de filtro carregado dentro de uma seringa de vidro etiquetada.
Isole os mosquitos no dia do experimento. Trabalhando sob o microscópio, quebre suavemente a ponta de dois capilares de borossilicato com filamentos usando um par de pinças. Antes de executar a eletroantenografia, ou experimento EAG, certifique-se de que os suportes de eletrodos estejam limpos por dentro, sem detritos de borossilicato.
Em seguida, realize a cloretação mergulhando os fios prateados dos suportes de eletrodos em água sanitária pura por cinco minutos, até que os fios fiquem escuros, cinza fosco. Em seguida, enxágue os fios. Solte a rolha de borracha e use uma agulha calibre 20 para preencher o interior do capilar com solução salina.
Enxágue os capilares e insira os fios nos dois capilares. Mantenha a ponta do fio a menos de um milímetro da ponta do capilar. Passe o capilar através do anel de borracha dentro do suporte do eletrodo sem quebrá-lo e aperte suavemente a rolha de borracha, depois de verificar se não há bolhas de ar presentes.
Use o capilar com a abertura mais larga no suporte do eletrodo de referência e a abertura menor no suporte do eletrodo de gravação. Deixe os dois suportes de eletrodos montados em um lenço de limpeza úmido para evitar que a ponta seque até que esteja pronta para montar a cabeça. Certifique-se de que a mesa de ar está levantada.
Não há bloqueio na companhia aérea e o ar está ligado. Verifique se o tanque de ar medicinal está cheio para evitar trocá-lo no meio do experimento e confirme bolhas no umidificador. Ligue os computadores, os aplicativos de software e a fonte de alimentação da válvula.
Depois de verificar a conexão com a internet, entregue um pulso de controle para verificar se a válvula que entrega os pulsos está funcional. Coloque uma placa de alumínio no gelo com um pedaço de lenço umedecido sobre ele e coloque um pequeno pedaço de gel de eletrodo em um canto. Coloque um copo de mosquito no gelo para deixar o mosquito esfriar.
Corte a ponta de cada antena do mosquito com micro tesoura. Use pinças para arrastar o mosquito ao lado do eletrodo de gel e mergulhe a ponta de cada antena suavemente no gel. Usando pinças, puxe as antenas do mosquito para fora, mantendo-as próximas umas das outras.
Pique a cabeça do mosquito usando micro tesoura. Mergulhe suavemente a ponta do eletrodo de referência no gel e coloque-o em contato com o pescoço, deixando a cabeça grudar nele. Coloque o eletrodo da cabeça de referência em um micromanipulador.
Conecte ambos os suportes de eletrodos ao amplificador. Use o micromanipulador para colocar o eletrodo de gravação o mais próximo possível das pontas da antena. Em seguida, insira as pontas da antena no eletrodo de gravação.
Coloque a tubulação da companhia aérea perto da preparação da cabeça do mosquito, a um centímetro. Ligue o amplificador e o redutor de ruído e certifique-se de que o sinal de linha de base não é barulhento. Quando o nível de ruído estiver satisfatório, insira a primeira seringa de odor no orifício da companhia aérea para realizar o teste e feche a gaiola de Faraday.
Em seguida, clique em gravar no software EAG para entregar o pulso. Meça as respostas do EAG como amplitude em milivolts e, em seguida, prossiga com o próximo odor ou concentração. O experimento demonstra com sucesso que espécies de mosquitos podem exibir respostas olfativas variáveis a diferentes produtos químicos.
Houve ausência de resposta ao óleo mineral, que foi utilizado como controle negativo. O erro nos resultados devido ao ruído elétrico pode ser reduzido aterrando os elementos na gaiola de Faraday, usando clipes de jacaré. O limiar de resposta ao mesmo odorante pode variar em magnitude para diferentes espécies de mosquitos.
Por exemplo, os mosquitos Toxorhynchites rutilus septentrionalis produzem EAGs muito grandes, em comparação com Aedes aegypti, Anopheles stephensi e Culex quinquefasciatus. Uma grande deflexão em resposta ao controle positivo, benzaldeído, foi notada. Enquanto houve falta de resposta ao controle negativo, o óleo mineral.
Essas respostas médias da antena são mostradas em um diagrama de barras. Além disso, o limiar de detecção de um produto químico específico para cada espécie de mosquito foi determinado apresentando a antena, as concentrações crescentes do produto químico e traçando uma curva dose-resposta. É importante iniciar a gravação o mais rápido possível após a cabeça ter sido cortada e montada, para garantir uma grande capacidade de resposta da preparação.
O EAG permite determinar se as antenas do mosquito respondem a um determinado produto químico em uma determinada concentração. No entanto, não permite determinar o equilíbrio deste produto químico. Por exemplo, se é um atrativo ou arrependimento.
