smFISH, mutlak sayıyı mRNA'ların alt hücresel konumu olarak ölçmesi ile bilinir. İki renkli sMFISH protokolümüz transkripsiyon ve mRNA bozulmasının kinetiklerini ölçme özelliğine sahiptir. Bu yöntem kullanılarak, birçok örnek ek süre veya çaba olmadan aynı anda işlenebilir.
Örneğin, 48 örnek veren dört zaman ders deneyi sekiz saat içinde görüntüleme için işlenebilir. Protokolümüz birçok gen ve bakteri türü için geniş ölçüde geçerlidir. Deney için kapak fişleri ve cam slaytlar hazırlamak için.
% 100 etanol içeren bir Coplin kavanoz kapak fişleri ve slaytlar yerleştirmek ve 15 ila 20 dakika boyunca bir su banyosu ultrasonik hitap kavanoz yerleştirin forseps kullanın. Sonication sonunda% 70 etanol ile kavanoz dolum ve sonication tekrarlamadan önce ultra saf su ile slaytlar ve kapak üç ila dört kez kayar yıkayın. Tüm sonication adımları yapıldığında, azot gazı ile kapak fişleri ve slaytlar kuru.
Kapak kaymasını boş 1000 mikrolitrelik pipet ucu kutusuna yerleştirin ve slaytları temiz bir slayt kutusuna yerleştirin. Daha sonra, pipet ucu kutusunun deliklerini takiben kapak fişleri üzerine daireler çizmek ve bu kuyuların her birine % 0.1 Poli l lsin 20 mikrolitre likit damla uygulamak için bir hidrofobik marker kullanın. Bir zaman kursu deneyi kurmak için, 20 mililitrelik üssel olarak büyüyen E.coli kültüründen 1,5 mililitrelik kültür tüpüne 750 mikrolitre ekleyin.
Ve hemen tüpü ters çevirin. 0.2-bir milimolar IPTG ile lac Z ifadesi indükleyin ve bir zamanlayıcı başlatın. Zamanlayıcıyı kontrol ettikten sonra, hücre kültürünü arka arkaya her deneysel zaman noktasında toplayın.
Deney sırasında uygun zaman noktasında, lak Z ifadesini bastırmak için şişeye beş milimolar ONPF ekleyin ve mRNA bozulmasını izlemek için kültürleri örneklemeye devam edin. Zaman kursu numune alımı sonunda, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında örnekleri kuluçka ve 30 dakika buz üzerinde kuluçka. Kuluçka sonunda fiksatif kaldırmak ve supernatant kaldırmak için bir pipet kullanmak için örnekleri santrifüj.
DePC PBS bir mililitre bakteri yeniden askıya ve yıkama başına taze DEPC PBS bir mililitre hücreleri iki kez daha yıkayın. Son yıkamadan sonra, 30 mikrolitre taze DEPC PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Hücrelerin permeabilizasyonu için.
İlk etanol steril cam kapak fişleri biri üzerinde bireysel hidrofobik kuyular için her zaman noktadan örnek ekleyin. Ve hücrelerin oda sıcaklığında 10 ila 30 dakikalık bir kuluçka ile kapak kayma uymak için izin verin. Kuluçka sonunda, her kuyuya %70 etanol15 mikrolitre ekleyin.
Dört dakika sonra, kuyular tamamen kuru böylece her kuyudan etanol aspire. Yıkandıktan sonra permeabilize hücrelerin her kuyusuna 30 mikrolitre prehibridizasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 derecelik bir fırında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ön hibridizasyon çözümünün yerine kuyu başına yaklaşık 30 mikrolitre prob hibridizasyon çözeltisi değiştirin.
Ve 37 santigrat derece fırında iki saatlik kuluçka için alüminyum folyo ile oda kapağı. Kuluçka sonunda kuyuları yıkama başına 30 mikrolitre yıkama çözeltisi ile 3-5 kez durulamak için çok kanallı bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, yıkama başına 30 mikrolitre taze DEPC PBS ile kuyuları beş kez yıkamadan önce hücreleri 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Son yıkamadan sonra, kapak kayma tüm sıvı aspire. Ve her kuyuya dört mikrolitre taze DEPC PBS ekleyin. Kapak fişini etanol steril cam slayt numunesinin üzerine dikkatlice yerleştirmek için terlikleri kullanın ve kapak fişinin kenarlarını kapatmak için silikon diş sakızını kullanın.
İlgi çekici bir alan bulmak için faz kontrast görüntüleme canlı modunu seçin ve bir kuyu içinde görüş alanını değiştirmek için sahne joystick manevra. Hücre yoğunluğunun en uygun olduğu bir alan ve faz kontrast hücre görüntüleri odak olacak şekilde Z odağı ayarlayın. Daha sonra dört saniye pozlama ile bir C beş görüntü elde, iki saniye pozlama ile bir C üç görüntü ve kuyu başına yaklaşık 10 farklı alanlar için 0,2 saniye pozlama ile bir faz kontrast görüntü.
Alternatif olarak, C beş, C üç ve faz kontrast görüntülerinin seri olarak elde edildiği bir NDI edinimi çalıştırılabilir. Tüm kuyular görüntülendiğinde, uygun bir hücre segmentasyon aracını açın ve yığına tıklamayı açın. İlgi alanı kontrast görüntülerini yükleyin ve bağımsız kareler seçin ve bilgi işlem aşaması profilini sıfır olarak tıklatın.
Hücrelerin tanımlandığı ve konturları hesaplanacaktır segmentasyon sürecine başlamak için. GitHub klasöründe sağlanan parametreleri yükleyin ve tüm kareleri tıklatın. İşlemin sonunda mesh görselleştirmek için kontur seçin.
Ardından, nokta algılama sekmesi altında, yığını niçin denetleyin, meshes kontrol edin ve iki D Gaussian uydurma dayalı nokta tanımlama ve nicelik başlamak için ovmak tıklatın. Floresan görüntüleri içeren klasörü ve hücre algılama yordamından yeni hesaplanan kafes dosyasını seçin ve nokta algılama sonuçlarının kaydedileceği dosya adını belirtin. Ardından, floresan görüntülerini analiz etmek için GitHub'da sağlanan görüntü analizi iş akışını kullanın.
Bu tam görüş alanında hücre segmentasyonu için iyi bir yoğunlukta yaklaşık 500 E.coli hücresi görülebilir. Faz kontrast görüntüleri hücrelerin morfolojisi segmentasyon amaçlı canlı hücrelerin ki karşılaştırılabilir kalmalıdır. Hücreler aşırı permeabilize ise, onların morfolojisi segmentasyon için uygun hale gelecektir.
İndüksiyon öncesi lak Z mRNA nokta yoğunluklarının dağılımı, yüksek yoğunluklu lekelerin varlığı nedeniyle normal veya Poisson dağılımına uymaz. Lac Z ekspresyonu indüklendiğinde, üç asal lak Z mRNA sinyali artmadan önce beş asal lak Z mRNA sinyali artar. Lak Z ifadesi bastırılırsa hem beş hem de üç ana lak Z mRNA sinyalleri azalır.
Transkripsiyon uzama oranını elde etmek için, beş ve üç asal sinyallerin yükselişi çizgilerle uyum sağlar. MRNA bozulma oranı, çürüme bölgesinin üstel bir fonksiyonla donatılması ile elde edilir. Tek moleküllü balıktek hücre tekniği olduğundan transkripsiyondaki hücreden hücreye değişkenlikleri de analiz edilebilir.
Buna ek olarak, beş asal ve üç prime lak Z mRNA'nın kolokalizasyonunun analizi, lak Z geniüzerindeki RNA polimerazların yoğunluğunun ölçülmesine olanak sağlar. Farklı zaman noktalarından örnekler bu işlem sırasında aynı anda ele alınır gibi. Numuneyi tüplerde ve kapak kapağındayken ayrı tutmak önemlidir.
Bu tek moleküllü tek hücreli mikroskopi tekniğini kullanarak. Araştırmacılar artık transkripsiyon ve mRNA bozunma kinetiklerinin mRNA'ların mutlak sayıları veya hücre altı konumları ile nasıl ilişkili olduğunu keşfedebilirler.
