Name: inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. FROS ile çoğaltma Engelleme <ol><li> Çoğaltma Blokaj uyaran <ol><li> Bir E. taze bir gecede kültür sulandırınız OD 600 Nm = seyreltik kompleks ortam içinde 0.01 bir teto dizi ve pKM1 18 taşıyan E. coli suşu (% 0.1 tripton,% 0.05 maya özü,% 0.1 NaCl, 0.17 M KH 2 PO 4, 0.72 MK 2 HPO 4) antibiyotik gerektiğinde seçimi için. Not: Bu sistemle uyumlu değil gibi seçim için tetrasiklin katmayın. Gerekli örnek başına 10 ml eşdeğer kültür hacmini olun. Örneğin, Şekil 1 &#39;de deney dizaynı kültür hacmi 60 ml&#39;dir. </li><li> OD 600 nm = 0.05-0.1 kadar çalkalanarak 30 ° C&#39;de büyütülmüştür. indüklenmemiş kontrol olarak görev yapar ve pKM1 gelen TetR-YFP üretimini sağlamak için kalan kültür,% 0.1 arabinoz ilave bir 10 ml lik bir numuneyi çıkarın. uyarılmamış ve uyarılmış hem de büyümeye devamkültürler. 1 saat sonra, (bakınız bölüm 2) floresan mikroskopi kullanılarak oluşturulan kültür her hücrede tek bir odak noktası olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Kaynaklı hücreler (hücre% 70&#39;den fazla, tek bir odak var) bloke teyit ise, OD 600Nm kaydetmek ve 2-D jelleri (Bölüm 3) ile analiz için bir 7.5 ml örnek almak. uyarılmamış kontrol kültüründen eşdeğer bir örnek almak. </li></ol></li><li> Çoğaltma Blokaj Releasing <ol><li> Çoğaltma blok serbest bloke hücrelerinin 10 ml&#39;lik bir numune karşılıksız indükleyici anhydrotetracycline (AT), 100 ng ml -1 ekleyin. 10 dakika boyunca 30 ° C&#39;de büyür ve hücre yoğunluğunda (1 mi), mikroskopi analizi (10 ul) ve nötr, nötr 2 boyutlu agaroz jelleri (7.5 mi) için numune almaya devam edin. </li></ol></li><li> Replizom Çöküşü uyaran <ol><li> Hücreler, dnaB TS veya dnaC ts gibi sıcaklığa duyarlı allel içeriyorsa bu deactiva gerektirirtion, 42 ° C&#39;ye kadar bloke hücreleri içeren piston hareket eder. Gerekli zaman noktalarında analiz için numune alın (ör 1 saat inkübe edildikten sonra). Hücreler, 1 saat boyunca 42 ° C&#39;de inkübe sonra, 10 dakika boyunca (Şekil 1 e bakınız) 30 ° C&#39;de hücreleri kaydırır. Not: Hücreler yeniden analizi için 30 ° C itilebilir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Şekil 1:. FROS Çoğaltma Blok ve Yayın Deneysel Prosedür Bakış E. teto dizilerini taşıyan E. coli suşu 30 ° C&#39;de yetiştirilir. Hücreler 0.05 yukarıda bir OD 600Nm ulaştığınızda, TetR-YFP üretim arabinoz ile indüklenir (ARA,% 0.1). indüklenmemiş hücrelerin bir alt 30 ° C &#39;de kontrol olarak hareket artmaya devam ediyor. 2 saat (2.1) - ile indüklenen hücre numunesi sonra 1 floresan mikroskobu ile analiz edilir. Çoğaltma iseengellenmesini teyit numuneler test tüpleri (bakınız 3.1) ile gösterilen 2-B jel analizi için ve (isteğe bağlı) canlılık testi için alınır. Çoğaltma blokaj (AT; 0.1 ug / ml) anhydrotetracycline ile temizlenebilir ve hücreler 10 dakika sonra incelendi. Hücreler (örneğin dnaB ts) bir sıcaklığa duyarlı allel taşıyan, bu uygun analiz için 42 ° C&#39;ye kadar bloke hücrelerin kaydırılarak inaktive edilebilir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Floresan Mikroskopi <ol><li> bir mikroskop lamı üzerine erimiş agaroz (su içinde% 1), 500 ul pipetleme bir agaroz pedi hazırlanması; Agaroz katılaşır hemen önce lamel kaplaması. kadar gerekli 4 ° C&#39;de ıslak dokularda slayt (ler) saklayın. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, agaroz ped ve pipetle bakteriyel 10 ul lamel kaldırmakpedinin merkezi üzerine kültür gözlem esnasında hücrelerin hareket etmesini önlemek için. örneği (yaklaşık 5 dakika) kuruduktan sonra, lamel değiştirin. kapak kayma üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve optik altında slayt yerleştirin. </li><li> 100X büyütmede Faz Mikroskobu kullanılarak Hücreler gözünüzde canlandırın. <ol><li> görüntüleme yazılımı içinde Edinme iletişim kutusunda, 100 milisaniye pozlama süresini ayarlayın. Edinme seçerek görüntüyü yakalamak. sahne hareket etmiyor. Edinme iletişim kutusunda, Kamera bağlantılı Dış Shutter için aydınlatma olarak YFP seçin. 1000 msn MARUZ KALMA saatini ayarlayın. sahne ışık kapatın. Edinme seçerek floresan görüntü yakalamak. Not: Zaman kullanılan ışık kaynağı, mikroskop ve kamera bağlı olarak değişebilir. </li><li> faz ve floresan görüntüleri bindirmek için, Renkli Ekran menüsü içinden birleştirin seçin. Renk iletişim kutusunda, birleştirin yeşil bileşen ve bl olarak faz görüntüsü olarak YFP görüntü seçinUE bileşeni. birleştirmek renk üzerine tıklayın. nüfus başarıyla hücrelerin çoğunluğu hücre başına bir odak olup olmadığını kurarak çoğaltma bloke eden olup olmadığını belirlemek. Not: Görme EYFP üretim farkı tanımlamak için eklenen arabinoz olmadan denetimi bir örnek karşılaştırılması yararlıdır. </li></ol></li></ol> 3. DNA Ekstraksiyon / Agaroz Fişler <ol><li> adım 1.1.3 ve 1.2.1 7.5 ml kültür örnekleri, sodyum azid (% 0.1 son konsantrasyon) eklenir. en az 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Not: Sodyum azit son derece zehirlidir. işe başlamadan önce Güvenlik Bilgi Formu&#39;na başvurunuz ve tüm güvenlik önlemlerini okuyup anlayana kadar idare yoktur. </li><li> 10 dk pelet hücreleri için hücreler 5000 xg santrifüj. Süpernatant atılır ve Pett IV (PIV), tampon 200 ul pelletini (10 mM Tris: HCl (pH 8.0), 1 M NaCI). Mikrosantrifüj (13, 2 dakika boyunca 000 x g) hücreler pelet. disüpernatant scard. Bu aşamada, -20 ° C &#39;de peletler ayrıca işlem veya mağazasında. </li><li> 50 ° C&#39;de 50 ul PIV ve yerinde en düşük hücre yoğunluğunda tekrar süspansiyon hücreleri. Nihai hücre yoğunluğu her tüp içinde aynı nedenle diğer tüm numuneler için, PIV hacimleri ayarlayın (50 ul yeniden süspanse örneğin Numune 1 (OD 600Nm = 0.128); Numune 2 54 ul içinde yeniden süspanse (OD 600Nm = 0.138)). <ol><li> PIV taze hazırlanmış% 0.8 agaroz çözeltisi eşit hacimde ilave edin (nihai konsantre% 0.4;., Örneğin Örnek 1 ila 50 ul, Örnek 2 54 ul). Numuneler, agaroz ve PIV katılaşmayı önlemek için 50 ° C&#39;nin üzerinde olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Uygun bir cam su itici veya silikon solüsyonu 40 ul bir mikroskop lamı davranın. kuruyana kadar bir doku ile slayt ovun. Not: Bu işlem, önceden yapılabilir ve işlenmiş Slaytlar, oda sıcaklığında uzun süreli saklanabilir. </li><li> t 20 ul damla yerleştirinO slayt hücre / agaroz süspansiyonu yarım küre olan fişleri üretmek. Not: (50 ul PIV içinde yeniden süspanse) İlk örnek bir slayt 5 fişleri üretecek. </li><li> Fişler katılaşan zaman, bir mikrofüj tüpü içine yavaşça kaydırıp 1 ml hücre lisis tamponu (10 mM Tris-HCI [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.2 sodyum deoksikolat,% 0.5 ekleme N-loroilsarkosin sodyum tuzu (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 lizozim, 50 ug mi 1 - RNaz A). 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hücre liziz tamponunu çıkarın ve 1 ml EDTA / sarkosil / Proteinaz K (ESP) çözeltisi (0.5 M EDTA,% 1 N-loroilsarkosin sodyum tuzu (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinaz K) ilave edilmektedir. bir gecede ya da fişler şeffaf olana kadar 50 ° C&#39;de inkübe edin. ikinci bir gece boyunca inkübasyon gerekli ise, yaklaşık olarak 18 saat sonra, taze tampon ESP çözeltisi değiştirin. </li><li> KaldırESP tampon ve her bir yıkama ile 30 dakika dengeleme sağlayan 12 ml Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) fişler 5 kez yıkayın. 1 ml TE tamponu içinde 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Nötr-nötr 2 Boyutlu Jel Elektroforez <ol><li> yeni bir mikrofüj tüpüne adım 3.8 arasında bir agaroz fiş aktarın ve sınırlayıcı enzim tamponu (1 x konsantrasyon) 150 ul ilave edin. Kısıtlama enzimi 25-100 birimleri ekleyin (EcoRV örneğin, 60 ünite; () Şekil 3A bakınız). 6-8 saat boyunca 37 ° C &#39;de özet. </li><li> 4 ° C &#39;de, yaklaşık 25 x 25 cm&#39;lik bir jel tepsisine 1x Tris / borat / EDTA (TBE) ve% 0.4 agaroz jeli (300 mi) dökün. yaklaşık kuyu tıpanın çapı ile aynı genişlikte yapmak için bir tarak yerleştirin. Jel ayarlandığında, tarak kaldırmak ve oda sıcaklığına jel taşıyın. </li><li> t kuyunun kenarına fiş düz slayt konumlandırma, bir kuyuya sindirilmiş agaroz fişleri birini SlideO DNA jel girecek. her iki yuva içine aynı şekilde tek bir düzensiz yerleştirin. </li><li> pozisyonunda fişleri mühür kuyulara agaroz erimiş% 0.4 Pipet. </li><li> boş oyuk yükleyin 1 kb DNA merdiveni, daha merdiven ve numuneler arasında bir boşluk bırakarak, ve oda sıcaklığında bir gece boyunca 1 x TBE içinde (16 saat, 55 V) jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> 20 dakika için etidyum bromid (0.3 ug ml-1) ihtiva eden bir su banyosu içinde jel leke. Not: Etidyum bromür güçlü bir mutajen ile bir toksin olarak kabul edilir. işe başlamadan önce Güvenlik Bilgi Formu&#39;na başvurunuz ve tüm güvenlik önlemlerini okuyup anlayana kadar idare yoktur. </li><li> Hatta sokağın her iki tarafında aşırı agaroz dahil en aza indirerek, kesme, bir uzun dalga UV transilluminator&#39;de ile DNA görselleştirmek ve düz her kulvar parçasını kesip. Not: Söz konusu parçacık, 5.5 kb Örneğin, approximat 5 kb DNA fragmanları dahil etmek için bir 7.5 cm fragmanı kesipely 12 kb (Şekil 3A bakınız). </li><li> DNA göçünü yönüne 90 ° &#39;de, bir jel tepsisine eksize jel şeridi yerleştirin. Not: 3 jel fragmanları İki sıra 25 x 25 cm 2 jel tepsisine sığabilir. Jel hatlarının ilk satırı 12,5 cm tepsi, ikinci sıra üst kısmında. </li><li> İkinci boyut jel (0.3 ug ml -1 etidyum bromür ile 1x TBE içinde% 0.9) için agaroz 300 ml hazırlayın. Agaroz, 50 ° C&#39;ye kadar soğutulur, konumlarını katılaşmaya jel dilimlerinin yaklaşık erimiş agaroz pipetle. Jel dilimleri ile en az seviyede derinliğe kadar tepsiye kalan agaroz dökün. </li><li> Jel bir kez katılaştınldıktan sonra DNA, yaklaşık 10 cm göç kadar, 220 V&#39;de 0.3 ug ml -1 etidyum bromür ihtiva eden 1 x TBE içinde 4 ° C&#39;de Electrophorese. 4 saat 5.5 kb fragmanı için yeterli ama daha küçük bir fragman daha az zaman gerekir: unutmayın. </li><li> Genomik DNA, mevcut u bloklar tüketim(Şekil 3C) görünmez DNA&#39;yı içerecek şekilde üstünde jel içeren, bir metal cetvel kenarını şarkı. </li></ol> 5. Southern hibridizasyonu <ol><li> Çözelti Hazırlama <ol><li> Depürinasyon tamponu (0.125 M HCl çözeltisi) hazırlayın. Not: Bu tampon yeniden kullanılabilir ve en fazla 1 ay boyunca oda sıcaklığında stabil olan edilebilir. </li><li> Denatürasyon tamponu (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) hazırlayın. Not: Denatürasyon tamponu kez tekrar edildi ve oda sıcaklığında 3 aya kadar stabildir edilebilir. </li><li> Nötralizasyon tamponu (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris) hazırlayın. HCI ile pH 7.5&#39;e ayarlayın. Not: Nötralizasyon tamponu kez tekrar edildi ve oda sıcaklığında 3 aya kadar stabildir edilebilir. </li><li> adım 5.2.4 ve 5.2.6 kullanılmak için - 10x Tuzlu sodyum sitrat (SSC), tampon (8, 0.15 M tri-sodyum sitrat, 1.5 M NaCl, pH 7) hazırlayın. Bu tampon, (aşama 5.2.9 kullanım için), bir 2X SSC stok yapmak. Not: 10x SSC ve 2x SSC3 ay boyunca oda sıcaklığında stabil yeniden. </li><li> Modifiye Church ve Gilbert, hibridizasyon tamponu 19 hazırlama (0.5 M fosfat tampon maddesi [pH 7.2],% 7 (ağırlık / hacim) sodyum dodesil sülfat (SDS), 10 mM EDTA, W). kullanmak için önce iyice erimesi için 65 ° C&#39;de bırakın. </li></ol></li><li> transfer <ol><li> bir rocker ya da orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca depürinasyon çözeltisi içinde kesilmiş jel blokları durulayın. agaroz blokları zarar görmesini önlemek için düşük ajitasyon hızı tutun. </li><li> 30 dakika denatürasyon tamponu ile kısaca damıtılmış su ile ve daha sonra jel blokları durulayın. damıtılmış su içinde kısa bir süre tekrar durulama ve daha sonra, oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile 30 dakika süreyle nötralizasyon tampon jel blokları inkübe edin. </li><li> jel (lar) tam boyutuna bir naylon zar kesilir. Gelecekteki adımlarla membran yönlendirmede yardımcı olmak için sağ üst köşede bir nick kesin. Not: İki jel blokları (6 adet) bir zar üzerinde görülebilir. </li><li> Bir tr içine yeterince 10x SSC dökünBugün o gecede kurumasına olmaz ki. yaklaşık 5 cm tampon seviyesinden bir platform oluşturmak. platformda 10x SSC ve yeri ile 3MM kromatografi kağıdı 3 yaprak doyurabilecek. membran jel sığacak kadar yeterince uzun süre her iki uçta da tampon dalmış ve geniş bir şekilde kromatografi kağıdı kesin. </li><li> doyurulmuş kromatografi kağıdı üzerine jel (ler) yerleştirin. by-pass transferi sırasında jel tampon önlemek için plastik örtü ile jel Çerçeve. Dikkatle jel (ler) üstünde kesme zarı yatıyordu. nazikçe zarından bir şişe veya serolojik pipet haddeleme zar ve jel arasındaki hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> membranın aynı boyutta 3MM kromatografi kağıdı üç yaprak kesin. 10x SSC ile kromatografi kağıdı yaprak Doymuş ve membran üstüne yerleştirin. oluşmuş herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Yığın kağıt katı bir destek tarafından takip kurutma kağıdı üstünde en az 5 cm yüksekliğinde havlular (beğenme23 x 16 cm membran için 1 kg ximate ağırlığı). Transfer gece boyunca ilerlemeye izin verin. </li><li> Zara DNA çapraz bağlanması için UV 1.200 J / m 2 membran (DNA yüzü yukarı) Açığa. Bu adımın öncesinde durulama yapmayın. </li><li> leke görüntülerde yüksek arka plan önlemek için 2x SSC iyice membran durulayın. 4 ° C&#39;de plastik wrap ve mağaza sarın, melezleme için hemen leke kullanın (5.3) veya oda sıcaklığında kurutun. </li></ol></li><li> melezleme <ol><li> Onceden hibridizasyon fırın ve 55 ° C şişeler. </li><li> 100 ug ml ilave -1 sığır serum albümini (BSA) ve 10 ug mi -1 spesifik olmayan DNA (örneğin somon sperm DNA&#39;sı) önceden ısıtılmış melezleme tamponu. </li><li> Hibridizasyon tamponu da kaplaması için zar sarıldığı esnada yukarı bakacak şekilde zarın, DNA&#39;ya bağlı yüzü örgü naylon Benzer boyutta kare üzerine leke yerleştirin. Uzun kenarı boyunca leke yuvarlayın. Kaymakleke / Bir melezleşme şişe içinde örgü. Leke göz önüne sermek için önceden ısıtılmış melezleme tamponu uygun miktarda (örneğin, bir 23 x 16 cm2 zar 30 mi). </li><li> 1 saat süre ile, şişe döndürme önceden ısıtılmış bir fırın içinde inkübe edin. </li><li> 13 ul lik bir hacim oluşturmak için Klenow fragmanı ve H2O için tampon, ilgilenilen bölgeye saflaştınlmış PCR ürünü, homolog 50 ng rastgele heksamer primerlerinin 150 ng karıştırılarak prob hazırlayın. 3 dakika sonra buz üzerine hemen yerleştirin kaynatın. 1 mM dCTP / dGTP / dTTP karışımı 1 ul, alfa fosfat- (α 32P-dATP) hakkında Klenow fragmanı (5U) ve 50 uCi deoksiadenozin 5&#39;-trifosfat radyoetiketlenmiş 1 ul ekle. </li><li> 1 saat süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin. mM dNTP karışımı 1 1 ul ve Klenow fragmanının 1 ul ekle. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca sonda kaynatın ve melezleme tüpleri hemen ekleyin. döndürme ile, 55 ° C&#39;de gece boyunca hibridize olur. </li><li> pr Durusuzardan obe. Not: prob kez yeniden yapabiliyor. </li><li> Önceden ısıtılmış, düşük sıkılık yıkama tamponu içinde kısa bir süre membran yıkayın (2X SSC,% 0.1 (a / h) SDS). Taze düşük sıkılık yıkama tamponu ilave edin ve rotasyon ile 55 ° C &#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Tekrar et. </li><li> Orta sıkılık yıkama tamponu içinde iki kez yıkayın (1 x SSC,% 0.1 (a / h) SDS) dönüşü ile 55 ° C&#39;de 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Yüksek sıkılık yıkama tamponu içinde iki kez yıkayın (0,1 x SSC,% 0.1 (a / h) SDS) dönüşü ile 55 ° C de 5 dakika karıştırıldı. </li><li> fazla sıvıyı çıkarmak için doku ile membran ve dab çıkarın. Önceden boşluklu depolama fosfor ekrana sahip poz kaset plastik wrap ve yerde hiçbir kalan nem yoktur sağlanması plastik wrap sarın. kaseti kapatın ve fosforlu bir görüntü cihazını kullanarak görselleştirme için en az 2 saat boyunca maruz kalmaktadır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+at+natural+impediments.">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li><li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli.">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li><li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro.">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication.">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li><li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li><li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli.">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li><li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal.">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li><li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves.">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li><li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes.">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li><li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli:+visual+evidence+for+distinct+mechanisms.">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li><li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo.">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li><li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli.">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae.">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li><li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis.">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli.">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li><li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo.">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing.">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li><li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks.">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li><li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks.">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li><li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA.">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li><li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons.">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li><li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli:+mechanism+and+genetic+control.">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most common impediment to replisomes in living cells is a nucleoprotein block2. However, two longstanding difficulties in studying the collision of a replisome with a nucleoprotein blockage have been how to localize the event to a known position on the chromosome and how to make the event frequent enough to allow detailed analysis. The majority of the knowledge of how E. coli copes with stalled/collapsed replication forks comes from the use of UV as a DNA damaging agent. 
The FROS protocol described here is a novel way of creating a site-specific nucleoprotein roadblock, similar to what the replisome will meet when it encounters proteins tightly bound to the chromosome during replication. The induced blockage and controlled release of this block allows the stages of DNA processing to be studied in discrete steps. The array of tetO sites used to block replication has previously been utilized to visualize chromosome organization9,10. While the array can be placed anywhere in the chromosome, for the purpose of the array described here, it should be distant from both the origin and the terminus to avoid complications in interpreting the signals observed from second rounds of initiation at the origin or from the replication fork proceeding around the opposite replichore. By optimizing the overproduction of TetR with the use of the dilute complex medium (protocol 1), we have found that sufficient TetR is produced to create a complete replication blockage that is stably maintained, while limiting the number of new rounds of replication that are initiated. The incorporation of replisome temperature sensitive mutations22 into the system ensures all replisomes are deactivated simultaneously and uncontrolled replisome reloading is prevented.
Whilst the number of foci per cell are useful for knowing the cell's replication status, the most enlightening data for DNA repair is from the analysis of the replication intermediates revealed by 2-D gel electrophoresis during an active replication blockage. Analysis of different genetic backgrounds can identify proteins involved in processing and restart of collapsed replication forks by the different patterns observed following the 2-D gel protocol. Further, intermediates from the processing of collapsed replication forks can be present at the array region or in the DNA upstream of the array, and can be visualized using 2-D gel electrophoresis. Creating duplicate agarose plugs (Protocol 3) has the advantage of allowing for digestion of the same sample with different restriction enzymes to be able to visualize replication intermediates in successive DNA regions. Therefore, the array region should be located in a position where appropriate restriction enzymes can be used to probe these regions of interest using Southern hybridization. 
The most common reasons that this technique may be unsuccessful are having either too little DNA which produces faint signals compared to background, or incomplete digestion of the DNA within the plugs. This can be caused by having too much DNA in the agarose plugs or the carry-over of some inhibitor from the lysis/washing steps. The number of cells taken for lysis within the agarose plugs may need to be varied from the protocol described here if modifications such as growth media are changed. However, it is futile to continue with the hybridization if the DNA in the plugs has not digested to completion. A repeat treatment of ESP may be required to better prepare the DNA (protocol 3.6). 
If the replication intermediates that are of interest are only transient, or are particularly rare within the cell, the DNA sample may need to be enriched for them, for example with the use of BND-cellulose which will bind short stretches of single stranded DNA, such as those found in replicating chromosomes23. Stabilization of replication intermediates by crosslinking with psoralen has also been used as a method of preserving DNA integrity24. When the intermediates are rare, it is important to optimize the probe and blocking of the membrane to prevent background signals from interfering. On completion of the blots the signals may be quantified with appropriate image processing software.
The protocol described here is an optimized system for creating a site-specific nucleoprotein blockage and analyzing replication intermediates when the replisome is unable to proceed through the blockage. With the establishment and optimization of this technique, the roles of various helicases and recombination proteins in processing the replication fork and in allowing the restart of replication can be identified. By varying the genetic background, the effect of the absence of these proteins can be analyzed. However, this technique is limited by requiring not only viable strains but strains that are also able to overproduce TetR at a rate that will create a stable nucleoprotein blockage.

DNA replikasyonu sırasında, replizom ilerlemesini bozan DNA engellerle karşılaşır. DNA lezyonları ve boşluklar da dahil olmak üzere hasar yanı sıra anormal yapılar 1 geçmeden gelen replizom önleyebilir. Son zamanlarda, DNA bağlanmış proteinler Çatal ilerlemesini 2 çoğaltma engel en yaygın kaynağı olduğu bulunmuştur. Bir nükleoprotein bloğu ile replizom karşılaşmasını izleyen olayların bilgisi önceden bilinen bir yerde canlı bir hücrenin kromozomu böyle bir blok ikna etmek yetersizlik ile sınırlı kalmıştır. In vitro analizi kinetik davranışları anlayışımızı arttırmıştır bir nükleoprotein tıkanması 3, hem de replizom kendisinin 4,5 mekanistik ayrıntıları karşılayan etkin replizom arasında. Çoğaltma tamir mevcut anlayış genelde in vivo 6-8 plazmid DNA kullanılarak zararlı madde olarak UV ile yürütülen ve incelenmiştir </s&gt; Yukarı. Bu genel olarak bu çalışmalardan anlaşıldığı edilebilir bir in vivo nükleoprotein blok karşılaştıktan sonra çoğaltma blok belirgin bir neden dolayı onarım yolları olan moleküler olaylar değişiklikler yine de orada olup, DNA onarımında yer alan proteinleri olabilir iken belirlenecektir. Burada, bir nükleoprotein blok Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanarak kromozomun belirli bir konuma kurulacak sağlayan bir sistem açıklanmaktadır. Biz E. bir yük kullanmaktadır 9. kromozomun içine dahil 240 TETO siteleri bir dizi olmuştur coli. Dizisi içindeki her bir teto Alanı dizi içindeki RecA-aracılı rekombinasyon önleyerek dizinin kararlılığını arttırmak için çevreleyen bir 10 bp rastgele dizisine sahiptir. Bu dizi, ve bunun varyasyonları, orijinal olarak E. anlamak için kullanıldı E. coli kromozom dinamikleri 10,11 ama sonra Preve adapte edildint in vivo çoğaltma 12. Dizi stabil bir şekilde muhafaza edilmesi ve TetR 10,12 bağlı, çoğaltma çatal% 100&#39;e yakın bloke bulunmuştur. 22 Yer replikasyon% 90 engellemek için yeterli olduğu gibi, bu daha kısa dizi in vivo 13 daha az etkili olmasına rağmen, in vitro içindeki lacO dizinin kullanımı, birkaç şekilde bulmuştur. Bir nükleoprotein tıkanma oluşturmak için diziyi uyarlamak için, bastırıcı protein yüksek o zaman bir barikat oluşturmak için dizinin bağlanır optimize koşullar altında aşırı üretilmektedir gerekir. Tet bastırıcısına bir floresan etiketli varyantı kullanıldığında bloke oluşumu, ve bunu takip eden serbest bırakma, floresan mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Her hücrede replikasyon durumu tek bir odak noktası dizinin yalnızca bir kopyası hücre içinde mevcut olan ve birden fazla odak aktif replikasyon göstergesi olduğu anlamına gelir görülen odaklarının sayısı ile gösterilir. Bu aktif yenidennükleoprotein blokaj replizom dizi üzerinden devam etmek için yeterli bir operatörün bir site için TetR bağlanma afinitesini azaltan karşılıksız indükleyici ilave edilerek tersine döndüğünde komplikasyondur etkinleştirilir. represör proteini de dizinin hemen birden çok kopyası görselleştirilebilir yeterince yüksek bir afinite ile DNA&#39;ya bağlanabilen. Nukleoprotein tıkanma olayların daha karmaşık ayrıntıları nötr nötr iki boyutlu agaroz jel elektroforezi ve Güney melezleme 14-16 kullanılarak tespit edilebilir. Bu teknikler nüfusun genelinde DNA yapılarının analizini sağlar. potansiyel etkinlik sırasında biçimlenmiştir ve çoğaltma ara görüntülenebilir, unrepaired kalır. Restriksiyon enzimi ve sonda kullanılan değiştirilmesiyle, ara dizi bölgede değil çoğalma çatala 17,18 geriler, diziye de yukan sadece görselleştirilebilir.regresyon replizom ayrışma sonra gerçekleşir; lider ve geri kalmış doğmakta olan iplikçikler bir dört yollu DNA yapısına (bir Holliday kavşağı) sonuçlanan şablon ipliklerini aynı anda yeniden tavlama olarak birbirlerine şablon teller ve tavlama ayrı. Bu blok 18 ile karşılaştığında, çoğalma çatala stabil değildir olduğu gösterilmiştir, bu sistemi kullanarak. Buna ek olarak, replizom bileşenleri ısıya duyarlı türevleri daraltılmış sonra çoğaltma çatalı yeniden önlemek için kullanılabilir. bir blok kurulduğunda, streyn replizom senkron devreden ve yeniden kontrollü bir engellenmesini sağlamak için bir non-permisif sıcaklığına kaydırılabilir. Bu sıcaklık kaynaklı devreden belirli bir zamanda çöktü nüfus içindeki çatallar tüm sağlar ve replizom DNA nasıl işlendiğini, çöker ve ne re gereklidir ne olur değerlendirilmesini sağlarDNA replikasyonu işlemini başlatmak. Burada açıklanan sistemin bir avantajı, nükleoprotein blok tam olarak geri dönüşümlü olduğunu; Bu nedenle, nükleoprotein bloktan kurtarmak için hücrelerinin yeteneği takip edebilmektedir. hücrelere anhydrotetracycline eklenmesi çoğaltma çatal ile devam sağlayan, sıkı bastırıcı bağlanmasını rahatlatacak ve hücre canlılığı yeniden. tıkanma kabartma 5 dakika sonra nötr nötr iki boyutlu, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilmiştir ve 10 dakika içinde mikroskop ile olabilir. Ayrıca, canlılık analizi çoğaltma tıkanıklık kurtarmak ve çoğalırlar devam etmek zorlanma yeteneğini ortaya çıkarabilir. Burada tarif edilen deney prosedürü kullanılan suşlar genetik arka planı değiştirerek, blokaj bu tip bakım yolları açıklanacaktır olabilir.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

sıkıca bağlı proteinler çeşitli lezyonlar dahil olmak üzere, DNA üzerindeki engeller, ciddi hücre çoğaltma makine ilerlemesini inhibe edebilir. Bir replizom duraklaması çoğaltma çatal yıkılışına yol açan, kromozomdan, ya kısmen ya da bütünüyle onun ayrışma yol açabilir. Bu çöküşün kurtarma hücresine doğru tam kromozomal çoğaltılması ve daha sonra bölmek için bir zorunluluktur. çoğaltma DNA çatal geri yükleme ve izin gerçekleşecek çöküş meydana geldiğinde, bu nedenle, hücre gelişti çeşitli mekanizmalar yüksek sadakat ile tamamlanacak. Daha önce, bakterilerden bu çoğaltma onarım yolları bilinen siteye lokalize olmama dezavantajına sahiptir, UV hasarı, kullanılarak incelenmiştir. Bu yazıda durdurduklarını ve replikasyon çöküşü fo uyarabilir bir siteye özgü protein bloğu oluşturmak için bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanan bir sistemi açıklamaktadırEscherichia coli RKS. replikasyon durumu, flüoresans mikroskopisi ve DNA replikasyon ara maddeleri kullanarak tek bir canlı hücrelerde görselleştirilebilir PROTOKOLLERİN detay 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Replizom bileşenleri (örneğin DnaBts) sıcaklığa duyarlı mutantlar çoğaltma çatal senkron çöküşü uyarılması için sisteme dahil edilebilir. Bundan başka, bu işlemlerde söz konusu rekombinasyon protein ve helikazlar rolleri bu sistem içinde, genetik Knockouts kullanılarak incelenebilir.

FROS canlı hücreler 12,18 görselleştirilebilir çoğaltma ara maddeleri sağlayan uyarılabilir, sahaya özel nükleoprotein bloktur. Hücreler numune için genel bir deney tasarımı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Genetik temelinde numune alma ve varyasyonlar ve zamanlaması, böyle bir bloğun onarım çalışmaları için çok yönlü bir sistem tercih. Şematik bir önceki 18 kullanılan bu tür dnaB TS ve TS dnaC olarak, sıcaklığa duyarlı mutantlar, bu sistemde de kullanılabilir verilmektedir. FROS indüksiyonu bir E. gerçekleştirildi Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, E. coli suşu olmayan ısıya duyarlı suşları için. Bir nükleoprotein blok kurulmuştur hücreler% 0.1 arabinoz büyüme 1 saat sonra floresan mikroskopi kullanılarak görselleştirilmiştir olduğunu doğrulamak için. BuZaman aralığı, bir vahşi tip suş içerisinde bir bloğun üretilmesi için ancak daha titiz suşlar optimizasyon gerektirebilir genellikle uygundur. Hücrelerin çoğu bu şekilde bloke edilmiş çoğaltma gösteren hücre içinde dizisinin sadece bir kopyasını uygun olarak 1 odak (Şekil 2A + ARA) içermektedir. 1 odaklama, 2 odaklar veya daha fazla 2 odağı olan hücre sayısı 100&#39;den fazla hücre popülasyonu sayılmıştır. Hücrelerin% 92 2 odaklarla kalan% 8 ile 1 odağı bulundu. Bu dizinin iki kopyasını temsil eden, iyi aralıklı iki odaklar vardı hücreleri bloke çoğaltma sonraki turda olurdu tahmin edilmiştir. İki odaklarla Hücreler birbirine yakın dizi son zamanlarda çoğaltılmış ve nükleoprotein blok henüz elde edilmemiştir delalet. nükleoprotein bloğu olarak görselleştirilebilen anhydrotetracycline (AT) ve bir dizi daha sonra tekrardan ilavesiyle tersine çevrilmiştirçok sayıda odak (Şekil 2A, + Ara / AT) ile hücrelerin birikimi. dizi delalet microcopy floresan tarafından görüntülendi bir hücre içinde birden fazla odaklar başarıyla çoğaltılmış ve yeterli süre mevcut olan herhangi bir kardeş kromozom uyumu üstesinden loci birbirinden hareket etmesine izin verecek geçti. Bu durumda, 10 dakika içinde ilave edilmesinden sonra, hücrelere 94% 2 veya daha fazla odak mevcuttu ve tekrar hücre başına en fazla 8 odaklar görselleştirilmiştir. Nükleoprotein bloğu Gerçekten replikasyonunu inhibe etmediğini sağlamak için, hücre canlılığı, (Şekil 2b) analiz edilmiştir. FROS inhibe çoğalması olan hücreler arabinoz mevcudiyetinde büyümemiş hücrelere göre koloni oluşturma birimlerinin içinde yaklaşık 1000 kat azalma göstermektedir. Daha sonra bu büyüme inhibisyonunun anhydrotetracycline göster ters mevcudiyetinde büyütülmüştür hücreler. Hücreler serbest bırakıldıktan sonra DNA onaramadığı olsaydınükleoprotein blokaj bölgesinin yaşayabilirliğini azalttığını neden olur. Çoğaltma ara maddeleri görselleştirmek için hücreler agaroz tıkayıcılann içinde lize edilebilir ve protein ve RNA çıkarıldı. DNA daha sonra ilgi bölgesi için uygun bir sınırlama enzimi ile sindirilmiş edilebilir. Şekil 3A&#39;da resimde DNA, ilgi bölgesi (Şekil 3B) 5.5 kb ve 6.7 kb fragmanlarının elde dizi içindeki ve dizi sonra, dizinin hemen önce DNA kesen EcoRV ile sindirildi. Fragmanlar, ideal olarak ~ Burada tarif edilen protokol için 3-7 kb. Bu aralığın dışındaki Fragmanlar iyi ayrılmasını sağlamak için kullanılan agaroz konsantrasyonları ve elektroforez koşulları değişiklik gerektirebilir. DNA, birinci boyutta elektroforezlendi ve görsel (Şekil 3A) ilave edildi. DNA tamamen sindirilmiş ise, tüm şeritler eşit çalıştırmak ve orada olacak(Yaklaşık olarak 3 kb daha azdır, kısıtlama enzimi ile ilgili olarak), düşük molekül ağırlıklı, yüksek miktarda. iyi düzenlenmiş bir DNA bu eksik DNA parçalanması anlamına gelir eksik hücre lizizine ve (10 kb üzerinde) yüksek molekül ağırlıklı DNA &#39;nın bir çok göstermektedir. Her kulvarda ilgili DNA çıkarıldı. Şekil 3A&#39;da, 5 kb yukarıda bahsedilen DNA dahil edildi. Jel daha sonra, ikinci boyutu Lineer DNA (Şekil 3C) bir çapraz sonuçlanan elektroforez uygulanmıştır. Bu jel içinde dizi DNA, Southern hibridizasyonu (Şekil 3D) ile görünür hale getirildi. (- Ara Örnek) engellenmesine beklendiği gibi, iki nokta, dizinin 5.5 kb ve 6.7 kb fragmanlarının karşılık gelen görülebilir. Çoğaltma (+ Ara) bloke eden numunesinin, numune içindeki Y biçimli DNA birikimi gösteren, buna karşılık 5.5 kb noktada bir azalmaya ve eliptik sinyal eklenmesini göstermektedir. sinyalidirçoğaltma çatal nüfus boyunca benzer bir yerde tutukluyorlar simgeleyen bir pozisyonda lokalize. anhydrotetracyline eklenmesi üzerine, Y biçimli bir DNA sinyal artık görülebilir. Son zamanlarda yeniden başlatma bölgesi boyunca göç çatalı gösteren tüm Y yay bir dikkat çeken varlığı ile gösterilir. Örneklerin sinyalleri daha emin olmak için, her agaroz fiş içinde DNA normalize etmek önemlidir. sinyaller uygun görüntüleme yazılımı ile belirlenebilir. görülen başka bir ortak ara belirten Holliday kavşağı (HJ) oluşmasıdır. Bir HJ Y-yay üstündeki bir koni sinyali ve Y yayı (Şekil 3B) sonunda doğrusal DNA&#39;dan bir başak olarak görüntülenmiştir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig2.jpg" /> Şekil 2: Floresan Mikroskopi ve Viab<html> ility. (a) bir E. teto dizilerini taşıyan E. coli suşu, 1 saat boyunca% 0.1 arabinoz (+ Ara) mevcudiyetinde 30 ° C&#39;de büyütüldü ve daha sonra anhydrotetracycline (AT) çoğaltma blok serbest bırakmak için bir alt popülasyonuna 10 dakika boyunca ilave edildi. Temsili mikrograflar YFP üretimi (üst panel) için gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 2 mikron. 1, 2 ya da en fazla 2 odak taşıyan hücrelerin oranı sayıldı ve bir yüzde (alt panel) halinde sunulmaktadır. (B) hücreler arabinoz bulunmaması durumunda yetiştirilir - arabinoz (+ ARA) ile (ARA) ve arabinoz, ve (en, 10 dakika) anhydrotetracycline hem seyreltilmiş 10-kat benekli veya çok agar ihtiva eden ampisilin üzerine yayılır ve her iki seri edildi ( - / + Ara örnekleri) ya da numune, anhydrotetracycline (+ ile ampisilin) ​​ve hücre yaşama kabiliyetinin saptanması için 30 ° C sıcaklıkta büyütülür. En: temsilci plaka belirtilen seyreltilerde büyüme gösteren. Alt: Ortalama CFU / ml gösteren +/- SEM grafiği.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54434/54434fig3.jpg" /> . Şekil 3: hücrelerden bir nükleoprotein Blok DNA çoğaltma Intermediates Görselleştirme (A), genomik bir DNA (1 - Ara 2, + Ara, 3, + Ara / AT) agaroz tıkayıcılann içinde lize edildi ve EcoRV kısıtlama enzimi ile sindirildi % 0.4 agaroz jeli (55 V, 16 saat) ile ayrılmıştır. 3 kb, 5 kb, 10 kb bant gösterilmektedir. Beyaz kutular ile gösterilen 5 kb işaretleyici yukarıda bahsedilen DNA çıkarıldı. Dizi bölgenin EcoRV sindirmek (B) şematik. Hücreler arabinoz varlığında yetiştirildiği zaman kaynaklı dizi giren çoğaltma çatal 5.5 kb fragmanı olan tıkanır. Sınırlama alanları, oklar ve Ar ile gösterilir kullanılanışını çizgileri olan bir kutu olarak gösterilir. (C) Kesilen DNA 90 ° döndürülür ve% 0.8 agaroz jeli (220 V, 4 saat) ayrılmıştır. beyaz kutu ayrıldıktan sonra DNA eksizyonu gösterir. (D) bir dizi bölgesi, daha sonra bir dizi bölgeye radyoaktif prob kullanılarak Southern leke analizi ile görselleştirildi. Bu pozisyonda bir çoğaltma bloğu ile Hücreler Y-yay üzerinde bulunan 5.5 kb fragmanına tekabül eden bir sinyal olacaktır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K Görüntüleme.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Video: Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Genetik

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Biyomühendislik

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Biyokimya

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biyoloji

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler