Bu protokol venöz malformasyonların histopatolojisini özetleyen hasta kaynaklı ksenogreftler oluşturmak için kullanılabilir. Bu daha bizim preklinik terapötik test taşımak için izin verildi. Bu teknik, hastanın doğrudan endotel hücrelerinin büyümesini ve deneysel tedaviye yanıtın günlük olarak izlenmesini sağlayan hızlı ve güvenilir bir NVivo sistemi sağlar.
Bu yöntem, vasküler veya lenfatik anomalilerin diğer türlerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir. Enjeksiyon için hücre süspansiyon hazırlayarak başlayın. Endotel hücrelerini beş mililitre önceden ısıtılmış %0.05 tripsin-EDTA ile 37 derecede iki dakika boyunca deneyin.
Tripsin nötralize ve EGM beş mililitre ekleyerek ve 150 mililitre konik tüp içine hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 400 kez G santrifüj sonra supernatant aspire ve EGM üç mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri hemositometreile say.
İstenilen hücre sayısı ile hacmi yeni bir 50 mililitrelik konik tüp içine girişim ve santrifüj ile tekrar hücreleri pelet. Hücre peletgevşetmek için küçük bir hacim bırakarak supernatant aspire. Enjeksiyon başına 220 mikrolitre BMEM ile hücre peletini yeniden askıya alın.
Kabarcıklar oluşturmamak için emin olmak için buz üzerinde iyice hücre süspansiyon karıştırın. BMEM hücre kültürünü, pistonu çekerek bir mililitrelik şırınga nın içine aspire edin. Şırıngaya 26 kalibrelik steril bir iğne kilitlersiniz ve hazırlanan şırıngaları enjeksiyondan önce buzun üzerinde sabit tutarsınız.
Farenin düzgün bir şekilde anestezi altında olmasını sağladıktan sonra midesine yerleştirin ve enjeksiyon bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin. Yavaşça herhangi bir yerleşmiş hücreleri askıya almak için hazırlanan şırınga rulo. Gıyabın sonuna kadar kabarcıklar ve hücre süspansiyon küçük bir hacim sınırdışı.
Yapı gibi bir çadır oluşturmak için enjeksiyon yerinde cilt çimdik. Sonra derinin altına iğne sağ yerleştirin ve iğne kas dokusuiçine enjeksiyonu önlemek için çimdik deri serbest bırakarak sadece derin olduğundan emin olun. İğneyi tutmak, küçük bir küresel kütle oluşturmak için hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini dikkatlice enjekte edin.
Kas içine hücre süspansiyon enjekte önlemek için dikkat edin. Her fişin uzunluğunu ve genişliğini bir kaliper ile ölçün. Kesilen ksenogreft fişleri cetvelin yanındaki kesme tahtasına hizala ve lezyonların brüt vaskülaritesini kaydetmek için bir görüntü alın.
Daha sonra fişleri oda sıcaklığında bir gecede %10 formalin batırarak düzeltin. Diseksiyondan sonra, lezyon fişleri histolojik analiz için işlenir ve fiş içinde insan kaynaklı endotel hücrelerini tespit etmek için UEA-1 için lekeli. Çakışmayı önlemek için lezyon kesitinde X düzlem deseninde 20 X büyütmede parlak alan mikroskobu ile lezyon kesiti başına beş HPF görüntü alın.
Çekilen resimlere bir ölçek çubuğu eklediğinden emin olun. Görüntüdeki HPF görüntülerini açın J.To ölçek çubuğunun piksellerini kalibre edin, düz çizgi aracını kullanın ve ölçek çubuğunun üzerinden gidin. Ardından, Analiz et ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatarak ölçülen pikselleri milimetreye dönüştürün.
Sonraki tıklatıldığında Ölçümleri Analiz Et ve alanı seçin ve bindirmeye ekleyin. Analiz kullanarak HPF'nin toplam alan alanını ölçün ve bu ölçümü ölçmek için bu ölçüyü kaydedin. Ücretsiz el seçimleri aracını kullanarak UEA-1 pozitif vasküler kanalel olarak anahat.
Ana hatlarıyla açıklanan alanı ölçmek için Analiz ve Ölçü'ye tıklayın. HPF içindeki tüm vasküler kanalları ölçün. Her bölümde alınan beş HPF işlemini tekrarlayın ve daha fazla analiz için değerleri Excel'e aktarın.
Daha sonra el yazması yönlere göre vasküler alan ve vasküler yoğunluk yüzdesini hesaplayın. Bu protokol kullanılarak TIE2 veya PIK3CA hiperaktif mutant endotel hücreleri ile lezyon fişleri gözle görülür vaskülarize edilir ve enjeksiyondan sonraki yedi ila dokuz gün içinde perfüzyona alınır. Lezyon fişleri insan VM dokusunun histopatolojik özelliklerine çok benzer ve ince bir endotel hücresi tabakası ile hizalanmış büyük vasküler kanallar görülebilir.
Bu vasküler yapılar genellikle ev sahibi fare vaskülatürü ile fonksiyonel anastomoz doğrulayan eritrositler içerir. İnsana özgü lektin UEA-1 kullanılarak yapılan immünohistokimyasal boyama, vasküler bölgeleri kaplayan hücrelerin fare vaskülatürü yerine insan implante edilmiş hücrelerden elde edildiğini doğrular. Bu prosedürü takiben, deneysel tedavilerin spesifik etkilerini analiz etmek için proliferasyon veya apoptoz belirteçleri için lezyon bölümlerinin ek boyanması yapılabilir.
Bu scenografik model vm hastaları için çeşitli klinik çalışmalarda etkinliğini göstermiştir mTOR inhibitörü rapamisin gibi venöz malformasyon için yeni tedavilerin preklinik çalışmalariçin kullanılmıştır.
