يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء xenografts المستمدة من المريض التي تُكَلِمُ علم الأنسجة الهدّانات من التشوهات الوريدية. وقد سُمح لهذا أيضاً بحمل اختباراتنا العلاجية قبل الفحص. توفر هذه التقنية نظام NVivo سريع وموثوق به يسمح بالرصد اليومي لنمو الخلايا البطانية المباشرة للمريض والاستجابة للعلاج التجريبي.
يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للتحقيق في أنواع أخرى من الشذوذ الوعائي أو اللمفاوي. تبدأ من خلال إعداد تعليق الخلية للحقن. تريبسينيز الخلايا البطانية مع خمسة ملليلترات من قبل warmed 0.05٪ tripsin-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
تحييد tripsin وإضافة خمسة ملليلتر من EGM وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 150 ملليلتر. جهاز طرد مركزي إلى 400 مرات G لمدة خمس دقائق ثم pirate فائقة و resuspend الخلايا في ثلاثة ملليلتر من EGM. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت.
المغامرة في حجم مع عدد الخلية المطلوب في أنبوب جديد مخروطي 50 ملليلتر و بيليه الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. التعرق مُندفع ترك حجم صغير لتخفيف بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية مع 220 ميكرولترات من BMEM لكل حقنة.
خلط تعليق الخلية جيدا على الجليد مع التأكد من تجنب خلق فقاعات. التعرق الخلية BMEM مزيج في حقنة المليلتر واحد فتح عن طريق سحب المكبس. عليك قفل إبرة معقمة قياس 26 إلى الحقنة والحفاظ على المحاقن المعدة شقة على الجليد قبل الحقن.
بعد التأكد من أن الماوس قد تخدير بشكل صحيح وضعه على بطنه وتطهير منطقة الحقن مع 70٪ الإيثانول. لفة بلطف حقنة أعدت لإعادة تعليق أي خلايا استقر. فقاعات تقشر إلى نهاية الحقنة وطرد حجم صغير من تعليق الخلية.
قرصة الجلد في موقع الحقن لإنشاء خيمة مثل هيكل. ثم أدخل الإبرة مباشرة تحت الجلد وتأكد من أن الإبرة هي فقط الجلد العميق عن طريق الإفراج عن الجلد قرصة لمنع الحقن في الأنسجة العضلية. عقد الإبرة باطراد حقن بعناية 200 ميكرولترات من تعليق الخلية لخلق كتلة كروية صغيرة.
الحرص على تجنب حقن تعليق الخلية في العضلات. قياس طول وعرض كل قابس مع الفرجار. محاذاة المقابس xenograft تشريح على لوحة القطع بجانب مسطرة واتخاذ صورة لتسجيل الأوعية الدموية الإجمالية للآفات.
ثم إصلاح المقابس عن طريق غمر لهم في 10٪ formalin بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. بعد تشريح، تتم معالجة مقابس الآفة للتحليل النسيجي وملطخة لUEA-1 للكشف عن الخلايا البطانية المشتقة من الإنسان داخل المكونات. اتخاذ خمس صور HPF لكل قسم الآفة مع المجهر الميداني مشرق في 20 X التكبير في نمط طائرة X داخل قسم الآفة لتجنب التداخل.
تأكد من تضمين شريط مقياس على الصور المُتَخَذة. افتح صور HPF في الصورة J.To معايرة وحدات البكسل لشريط المقياس، واستخدم أداة الخط المستقيم واذهب فوق شريط المقياس. ثم تحويل بكسل قياس إلى ملليمترات عن طريق النقر على تحليل وتعيين مقياس.
انقر بعد ذلك على تحليل مجموعة القياسات وحدد المنطقة وإضافة إلى تراكب. قياس المساحة الحقلية الإجمالية لـ HPF باستخدام تحليل وقياس حفظ هذا القياس للقياس الكمي. باستخدام أداة التحديدات من جهة حرة الخطوط العريضة يدويا قناة الأوعية الدموية UEA-1 إيجابية.
انقر على تحليل وقياس لتحديد المنطقة المحددة. قياس جميع القنوات الوعائية داخل HPF. كرر العملية لـ HPF الخمسة التي تم التقاطها داخل كل قسم ثم قم بنقل القيم إلى Excel لمزيد من التحليل.
ثم حساب النسبة المئوية لمنطقة الأوعية الدموية وكثافة الأوعية الدموية وفقا لاتجاهات المخطوطات. باستخدام هذا البروتوكول يتم دمج القرّة مع خلايا البطانية المتحولة المفرطة في PIK3CA في أوعية وعائية بشكل واضح في غضون سبعة إلى تسعة أيام بعد الحقن. تشبه مقابس الآفة إلى حد كبير الملامح الهستوولوجية للأنسجة الظاهرية البشرية والقنوات الوعائية الكبيرة التي تتماشى مع طبقة رقيقة من الخلايا البطانية مرئية.
تحتوي هذه الهياكل الوعائية عادة على كريات الدم الحمراء التي تؤكد أنمائي وظيفي مع الأوعية الدموية الماوس المضيف. إن التلطيخ المناعي الكيميائي باستخدام الليكتانات البشرية المحددة UEA-1 يؤكد أن الخلايا التي تبطن مناطق الأوعية الدموية مشتقة من الخلايا البشرية المزروعة بدلاً من الأوعية الدموية للماوس. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تلطيخ إضافي لأقسام الآفات لعلامات الانتشار أو المبرمج لتحليل تأثيرات محددة للعلاجات التجريبية.
وقد استخدم هذا النموذج scenographic للدراسات قبل السريرية من العلاجات الجديدة للتشوه الوريدي, مثل مثبطات mTOR rapamycin, التي أظهرت فعالية في العديد من التجارب السريرية لمرضى VM.
