Protokolümüz, ortopedik implantlar için metalin kasiküler kıkırdaklara karşı kaymasını test etmeyi ve böylece fokal implantların veya hemiartroplastinin belirli kondrasitlerin biyosentetik aktivitesi üzerindeki etkilerini araştırmayı mümkün kılarak bu tekniğin temel avantajı, kıkırdak eşleştirmesinde mekanik yüklemenin hem tribolojik özellikleri hem de biyolojik etkileri hakkında kapsamlı bir fikir edinilmesidir. Bu teknik, diz veya kalça hemiartroplastisi bir osteokondral defekti tedavi etmek için bir fokal metalik implantlar implantasyonu gibi cerrahi işlemler den sonra klinik bulgular iltifat olabilir. Prosedürü gösteren Christopher Bauer, Tuna Üniversitesi'ndeki laboratuvarımda doktora sonrası yapılacak.
Plaka konfigürasyonu, dikey yükleme yetenekleri ve ayarlanabilir yük ve sürgülü hız üzerinde bir silindir ile ticari olarak kullanılabilir bir karşılıklı tribometre kullanın. Ayrıca, bir sıvı hücre bir yağlama çözeltisi testleri gerçekleştirmek için gereklidir. Alt numune tutucudaki osteokondral silindirleri sürgülü yönle hizalanmış işaretleme ile düzeltin.
Bir basınç ölçüm filmi kullanarak kıkırdak sistemi üzerinde kobalt krom mobibim temas basıncı belirleyerek başlayın. Basınç ölçüm filmini arayüze yerleştirin ve ilk temas basıncını, temas boyutunu ve şeklini belirlemek için 30 saniye boyunca statik bir yük uygulayın. Kobalt krom mobibdenum silindirleri üst yük hücresine monte edin.
Osteokondral silindirbatık ve metal kıkırdak kayar arayüzü kapsayacak şekilde sıvı hücre içine test çözeltisi ekleyin. Test boyunca korunacak normal kuvvet darbesi ve sürgülü hızda açıklanan test parametrelerini ayarlayın. Metal silindirin, yağ çözeltisindeki eklem kıkırdağına karşı karşılıklı kaymaya başlayın.
Deney boyunca sürtünme katsayısını izlemek, deneyi sonlandırır. Arzu test süresinden sonra osteokondral fişi numune tutucudan alın ve daha fazla biyolojik analize kadar orta derecede saklayın. Test süresince kontrol numunelerini ve test çözümlerini oda sıcaklığında tutun ve mekanik yüklemeye maruz kalan numunelerle birlikte analiz edin.
Yer, bir ölçekte 24 kuyu plaka ve sıfır. Osteokondral fişi PBS ile durulayın ve petri kabına yerleştirin. Daha sonra bir neşter kullanarak kıkırdağı tek parça halinde ikiye bölerek kıkırdağı iki eşit parçaya ayırın, böylece temas alanı her iki kıkırdak parçasına eşit olarak dağıtılır ve bir yarısını yaklaşık bir milimetre küplü parçalara ayırın.
Gen ekspresyonu analizi için ikinci yarısında kullanın 24 iyi plaka hazırlanan bir kuyu içine kıyma kıkırdak aktarın ve doku ağırlığı her örnek için bu işlemi tekrarlayın ve plaka her kuyuya büyüme orta bir mililitre ekleyin. Her kuyuya 500 mikrolitre XTT çözeltisi ekleyin ve kuluçkadan sonra dört saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le plakayı kuluçkaya yatırın ve beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Tetrazolyum ürününü her kuyudaki kıkırdak dokusuna 500 mikrolitre DMSO ekleyerek çıkarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca sürekli ajitasyon uygulayın, DMSO çözeltisini çıkarın ve önceden toplanan XTT çözeltisi ile çekin.
Her numunenin 100 mikrolitresini triplicates'te 96 kuyu plakasına aktarın. 492 nanometre dalga boyunda emiciliği ölçmek için bir plaka okuyucu ve 690 nanometre referans dalga boyu kullanın. RNA kıyma izole etmek için küçük parçalar halinde osteokondral fiş elde edilen kıkırdak dokusunun ikinci yarısında seramik boncuk ve lisanslı tampon 300 mikrolitre içeren bir tüp doku aktarın.
%1 beta merkaptoetanol ile her koşudan sonra 20 dakikalık soğutma aşaması ile 20 saniye boyunca 6, 500 RPM uygulayan dokuyu homojenize etmek için ticari bir lysate kullanın. Her numuneye 20 mikrolitre proteinaz K ve 580 mikrolitre RNA'sız su ekleyin ve 55 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Numuneleri 10,000 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.
Her tüpe %90 etanol 0,5 cilt ekleyin ve karıştırın ve numunenin 700 mikrolitresini iki mililitrelik toplama tüpündeki RNA bağlama sütununa aktarın ve 8,000 kez G'yi 15 saniye boyunca santrifüj edin. Akış-through atın ve lysate geri kalanı için santrifüj adımı tekrarlayın. Sütuna 350 mikrolitre arabellek RW ekleyin.
8,000 kez G'yi 15 saniye boyunca santrifüj edin ve akışı atın. 10 mikrolitre DNA stok çözeltisini ve 70 mikrolitre tampon RDD'yi karıştırın. RNA arıtma membranına çözeltiekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın ve sütuna 350 mikrolitre tampon RW ekleyin.
15 saniye boyunca 8,000 kez G'de santrifüj edin ve rna arıtma sütununa 500 mikrolitre tampon RPE ekleyin ve 8'de santrifüj yapın, 15 saniye boyunca 000 kez G akışı atmak ve RNA arıtma sütununa tampon RPE başka bir 500 mikrolitre eklemek için sonra 8, 000 kez G iki dakika için yeni bir 1.5 mililitre toplama tüpü sütun yerleştirin ve 30 mikrolitre eklemek RNA'lar tüpü 8,000 kez G'de bir dakika santrifüj, rna sentezlenmiş cDNA'yı ticari bir kiterlik kullanarak ima edip tüm bölgeleri karıştırır, RNA örneğini ekleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi reaksiyon ve termal döngücünü gerçekleştirir. RTQ PCR ana karışımı dokuz mikrolitre ekleyin ve bir mikrolitre cDNA 96 iyi plaka her bir örnek triplicates ile pcr plaka parlar tavan yağı ve santrifüj ile 877 kez G dört derece santigrat 10 dakika RTQ PCR ve hassas ve termal çevrim gerçekleştirin. El yazması talimatlara göre.
Metal kıkırdak arayüzünde temas alanı ve temas basıncı test edilmeden önce bir basınç ölçüm filmi kullanılarak teyit edilmelidir. Fizyolojik yükleme durumu daha sonra tanımlanmış temas için referans çıkarım ile elde edilen künye karşılaştırılarak teyit edilebilir Düşük sürtünme katsayısı göç eden bir temas alanı ile en az bir saat boyunca muhafaza edilebilir. Hücre dışı matriks bileşimi ve yapısı safran ve O boyama ile belirlenebilir.
Safran ve O boyama yoğunluğu proteoglikan içeriği ile orantılıdır. Proteoglikan içeriği eklem yüzeyine göre değişir ancak temel numunelerde doku kesiti boyunca düzgün olmalıdır, mekanik yükleme ile etkisiz hale geçirilebilen glikozaminoglikanların ekstraksiyonuna işaret eder. Sığır eklem kondrasitlerinin metabolik aktivitesi hasat alanından bağımsızdır ancak mekanik yükleme ile birlikte artış gösterir.
Kıkırdak spesifik genlerin gen ekspresyonu düzeyleri fizyolojik yükleme koşulları ile artmıştır. Oysa katabolik genler sabit temas alanı ile yukarı düzenlenir. Bu işlemden sonra kıkırdak web ürünlerinin belirlenmesi ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak eklem yüzeyinin analizi dahil olmak üzere ek analizler yapılabilir ve ayrıca çeşitli tribolojik eşleştirmelerde eklem kıkırdağının yağlamasını optimize etmeye çalışırız.
