우리의 프로토콜은 관절 연골에 대한 정형 외과 임플란트용 금속의 슬라이딩을 테스트할 수 있게 해주며, 이로 인해 특정 연골의 생합성 활성에 대한 초점 임플란트 또는 헤미아트로플라스티의 효과를 조사할 수 있으며, 이 기술의 주요 장점은 연골 쌍에 기계적 로딩의 트리뷸릭 특성과 생물학적 효과에 대한 포괄적인 통찰력을 제공한다는 것입니다. 이 기술은 무릎의 골막 결점 또는 엉덩이의 hemiarthroplasty를 취급하기 위하여 초점 금속 임플란트의 이식 같이 외과 수술 후에 임상 사실 인정을 칭찬할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 다뉴브 대학의 내 실험실에서 포스트 독크리스토퍼 바우어가 될 것입니다.
플레이트 구성, 수직 적재 기능 및 조정 가능한 부하 및 슬라이딩 속도에 실린더가 있는 상용 왕복 트리보미터를 사용합니다. 또한 윤활 액에서 테스트를 수행하기 위해서는 액체 셀이 필요합니다. 하단 샘플 홀더의 골막 실린더를 슬라이딩 방향에 정렬된 마킹으로 수정합니다.
압력 측정 필름을 사용하여 연골 시스템에 코발트 크롬 몰리브덴의 접촉 압력을 결정하는 것으로 시작합니다. 압력 측정 필름을 인터페이스에 배치하고 30초 동안 정적 하중을 적용하여 초기 접촉 압력, 접지 크기 및 모양을 결정합니다. 코발트 크롬 몰리브덴 실린더를 상부 로드 셀에 장착합니다.
테스트 솔루션을 액체 셀에 추가하여 골연드랄 실린더를 침수하고 금속 연골 슬라이딩 인터페이스를 덮습니다. 테스트 전반에 걸쳐 유지될 정상 힘 스트로크 및 슬라이딩 속도에 설명된 것과 같은 테스트 매개 변수를 설정합니다. 윤활액에 침지된 관절 연골에 대한 금속 실린더의 상호 슬라이딩을 시작합니다.
실험 전반에 걸쳐 마찰계수를 모니터링하고 실험을 종료합니다. 욕망 시험 기간 후에 샘플 홀더로부터 골조장 플러그를 제거하고 PBS로 헹구고 생물학적 분석이 더 해질 때까지 매체에 저장한다. 테스트 기간 동안 제어 샘플과 테스트 솔루션을 실온에서 유지하고 기계적 적재에 노출된 샘플과 함께 분석합니다.
장소, 24 개의 우물 플레이트를 스케일에 제로. PBS로 골조오진드랄 플러그를 헹구고 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 이식편에서 연골을 1장으로 잘라 두 개의 동등한 조각으로 연골을 양분하여 접촉 영역이 연골 조각과 다진 반쪽을 약 1밀리미터 큐브 조각으로 동등하게 분배되도록 합니다.
유전자 발현 분석을 위해 하반기를 사용하여 다진 연골을 24웰 플레이트에서 제조된 우물로 옮기고 각 샘플에 대해 이 과정을 반복하는 조직 중량을 결정하고 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 성장 배지를 추가한다. 각 우물에 XTT 용액 500 마이크로리터를 넣고 혼합한 다음 배양 후 4시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 5밀리리터 튜브로 옮습니다. 각 우물의 연골 조직에 500 마이크로리터를 추가하여 테트라졸륨 제품을 추출하고 실온에서 1시간 동안 지속적인 교반을 적용하고, DMSO 용액을 제거하고 이전에 수집된 XTT 용액으로 당깁니다.
각 샘플의 100 마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 옮기다. 플레이트 판독기를 사용하여 492 나노미터의 파장에서 흡광도, 690 나노미터의 기준 파장을 측정합니다. 골다공드랄 플러그로부터 얻은 연골 조직의 후반부에 RNA를 분리하기 위해 세라믹 구슬과 300 마이크로리터를 함유한 튜브로 조직을 옮기는 작은 조각으로 조직을 이체한다.
1%베타 메르카토에탄올은 6, 500 RPM을 적용한 조직을 20초 4회, 20분 냉각단계로 균일화하기 위해 상업적용 용액을 사용합니다. 단백질Ase K 20 마이크로리터와 580 마이크로리터의 RNA 프리 워터를 각 샘플에 추가하고 30분 동안 섭씨 55도에서 배양합니다. 원심 분리는 10, 000 배 G에서 3 분 동안 샘플을 원심분리하고 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 전송합니다.
각 튜브에 0.5부의 에탄올을 넣고 혼합한 다음 샘플의 700마이크로리터를 RNA 결합 컬럼으로 2밀리리터 수집 튜브로 옮기고 원심분리기는 8, 000배 G에서 15초 동안 8, 000배 G로 옮긴다. 흐름 을 버리고 나머지 용액에 대한 중심화 단계를 반복합니다. 350 마이크로리터의 버퍼 RW를 열에 추가합니다.
원심 분리기는 8, 000배 G로 15초 동안 폐기하고 흐름을 폐기합니다. DNA 스톡 솔루션 10마이크로리터와 70마이크로리터의 완충RD를 혼합합니다. RNA 정화 멤브레인에 용액을 추가하고 실온에서 15분 동안 배양한 다음 350 마이크로리터의 완충RW를 컬럼에 추가합니다.
원심분리기는 8, 000배 G에서 15초 동안 폐기하고, 8시에 RNA 정화 열에 500 마이크로리터의 완충RPE를 첨가하고, 원심분리기를 8에서 폐기하고, 15초 동안 000배 G는 흐름을 버리고 RNA 정화 열에 완충 RPE 500 마이크로리터를 추가한 다음, 2분 동안 8, 000배 G에서 원심분리하여 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 컬럼을 배치하고 30마이크로리터를 추가했습니다. RNA 무료 물 원심분리기 튜브는 1분 동안 8, 000회 G로, 상용 키트를 사용하여 RNA 합성 된 cDNA를 암시하고 모든 영역을 혼합하고 RNA 샘플을 추가하고 텍스트 원고에 설명 된 바와 같이 반응 및 열 사이클러를 수행합니다. RTQ PCR 마스터 믹스 9마이크로리터와 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 cDNA 마이크로리터 1개를 추가하여 천장 오일과 원심분리기로 PCR 플레이트를 천장 오일과 원심분리기로 4도에서 10분 동안 877회 G로 빛난다. 원고 의 지시에 따라.
금속 연골 인터페이스에서 접촉 영역 및 접촉 압력을 테스트하기 전에 압력 측정 필름을 사용하여 확인되어야 합니다. 생리적 적재 상태는 상기 정의된 접촉에 대한 참조 추론과 얻어진 각인을 비교하여 확인할 수 있고 낮은 마찰 계수는 마이그레이션 접촉 영역과 적어도 1시간 동안 유지될 수 있다. 세포외 매트릭스 조성 및 구조는 사프란 및 O 염색으로 결정될 수 있다.
사프란과 O 염색의 강도는 프로테오글리칸 함량에 비례합니다. 프로테오글리칸 함량은 관절 표면에 따라 다르지만 기준선 샘플의 조직 섹션 전체에 균일해야 하며, 기계적 적재에 의해 중화될 수 있는 글리코아미노글리칸의 추출을 보여준다. 소 관절 연석의 대사 활동은 수확 부위와 무관하지만 기계적 적재로 증가를 나타낸다.
생리적 적재 조건으로 증가 된 연골 특정 유전자의 유전자 발현 수준이 증가했습니다. 이화 유전자는 고정 접촉 영역으로 업 규제되는 반면. 이 절차에 따라 연골 웹 제품의 측정 및 스캐닝 전자 현미경을 이용한 관절 표면 분석을 포함하여 추가 분석을 수행할 수 있으며, 또한 다양한 마찰학적 쌍으로 관절 연골의 윤활을 최적화하려고 노력합니다.
