Protokolümüz, ffpe kaynaklı RNA örneklerinden, özellikle de optimal olmayan kalite örneklerinde üretilen gen ekspresyonu verilerinin kalitesini ve miktarını artırmak için kullanılabilir. Bu teknik, FFPE doku örneklerindeki RNA kalitesini değerlendirir ve numune sıralama verilerinin miktarını ve kalitesini artırmak için akış aşağı işlemelerinin optimizasyonuna olanak sağlar. Bu yöntem, biyolojik ve klinik örneklemde bir transkriptin kapsamlı karakterizasyonuna olanak sağlar ve genomun gelişim ve hastalıktaki fonksiyonel unsurları hakkında bilgi sağlayabilir.
FFPE-RNA bozulması ve örnek QC, kütüphane hazırlama ve veri analizi için yöntemlerin seçimi tüm çok zor olabilir. Doğru yöntemleri ve uygun kontrolleri seçerken titiz olun. Görsel gösterim, izleyicilerin planlama, değerlendirme ve özellikle kötü korunmuş FFPE örnekleri için sıralama işlemi sırasında gereken küçük ince değişiklikleri ve önlemleri gözlemlemelerini sağlar.
RNA numunesinin kalitesini kontrol etmek için, numuneyi üreticinin talimatlarına göre bir RNA QC sisteminde çalıştırın ve numune içindeki RNA parçalarının dağılımını analiz etmek ve 100 ve 200 nükleotitten daha uzun parçaların oranını hesaplamak için uygun biyoanaliz yazılımını kullanın. QC ölçümlerine dayanarak, bu numunelerin işlenmesinden dışlanmasına izin vermek için 100 nükleotitten daha uzun parçaların %40'ından azına sahip örnekleri tanımlayın. Sıralama için, oda sıcaklığındaki su banyosunda çalışma parametrelerine göre uygun sıralama reaktif kitlerini eritin ve çözülmeden sonra reaktif tepsisini dört derece yedirin.
Akış hücre paketini oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirin. Paket ısınırken, Illumina Deney Yöneticisi uygulamasını açın ve Örnek Sayfa Oluştur'u seçin. Kullanılacak sıralayıcıyı seçin ve İleri'yi tıklatın.
Reaktif kiti barkodunu ve diğer uygun iş akışı parametrelerini girin. Ardından, Illumina sıra ölçütlerine göre oluşturulmuş bir örnek sayfa yükleyin. Örnek kitaplığı ve kontrol kütüphanesi PhiX hazırlamak için, dennature ve uygun konsantrasyonlarda kütüphaneler seyreltmek ve% 5 PhiX kontrol hacim oranı elde etmek için örnek ve PhiX kontrol kütüphaneleri karıştırın.
Akış hücreleri hazır olduğunda, sarma yıkın, tüy bırakmayan bir alkol mendili ile cam yüzeyi temizleyin ve bardağı düşük bir tiftik laboratuvar dokusuyla kurulayın. Reaktif kartuşu dört santigrat derece depolama dan çıkarın ve reaktifleri karıştırmak için kartuş beş kez ters. Hava kabarcıklarını azaltmak için tezgahtaki kartuşa hafifçe dokunun ve denatüre ve seyreltilmiş numuneyi belirlenen rezervuardaki reaktif kartuşuiçine yükleyin.
Akış hücresini, arabellek kartuşu'nu ve reaktif kartuşu'nu sisteme yükleyin. Ardından otomatik bir denetim yapın ve çalışma parametrelerinin sistem kontrolünden geçmesini sağlamak için çıktıyı gözden geçirin. Otomatik denetim tamamlandığında, sıralama çalışmasına başlamak için başlat'ı seçin.
İşlem öncesi QC ve hizalama sonrası QC sonuçlarını görselleştirmek için, HTML biçiminde toplu bir rapor oluşturmak için çoklu QC çalıştırın. Toplu iş efektlerini belirlemek ve verilen veri kümesinin kalite haritasını değerlendirmek için, temel bileşen çözümlemesi çalıştırmak için bir R komut dosyası kullanın. Örnek korelasyon analizi daha sonra farklı numuneler arasındaki Pearson korelasyon kullanılarak yapılabilir.
100 nükleotitten uzun olan parçaların oranının tahmini, 200 nükleotitten uzun olan parçaların tahmininden daha yararlıdır, çünkü yüksek oranda bozulmuş RNA örnekleri için daha küçük parça boyutlarının oranını doğru bir şekilde ölçmek için daha hassastır. Örnek kümesindeki yüksek bozulma derecesi göz önüne alındığında, toplam RNA kitaplık hazırlama yöntemi önerilir. Örneğin, burada dört farklı örnekten hazırlanan sıralama kitaplıkları gösterilmiştir.
Burada, ham FastQ dosya sıralama kalitesi ve örnek bağdaştırıcı içeriğine genel bakışlar gösterilmiştir. FastQC taraması, numuneler içindeki bakteriyel veya fare kontaminasyonu gibi kontaminasyonun saptandırılabiliyor. STAR hizalaması, referans genomuna eşlenen okumaların oranını, referans genomuna benzersiz bir şekilde eşlenen okuma ların yüzdesini ve eşlenmemiş veya birden fazla loci ile eşlenen okuma ların oranını belirlemek için kullanılabilir.
Kart ve RSeQC istatistikleri, haritalanmış okumalarda bulunan haberci RNA'ların, intronic ve intergenik üslerin yüzdesini belirlemek için kullanılabilir. Bu temsili analizler için, bazı bozulmuş kütüphaneler, daha fazla okuma beş asal sonuna göre üç asal yakın eşlenen üç asal önyargı vardı. Buna ek olarak, her numunenin biyolojik kopyaları için ana bileşenler tarafından yakalanan toplam varyasyonun yüzdesini belirlemek için temel bileşen analizi yapılabilir.
Örnek bozulmasını önlemeye özen, her örnek için çoğaltmalar ve birden fazla kat hazırlamak, örnek kalitesini değerlendirmek için uygun ölçümleri kullanmak ve doğru kitaplık hazırlama yöntemini kullanmak. Bu metodoloji kullanılarak, daha önce kullanılmayan FFPE örnekleri ile çeşitli hastalık durumları hakkında bilgi edinmek için çeşitli depolama süreleri ve koşulları ile daha büyük NGS çalışmaları yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların ffpe numunesinin mevcut büyük arşivlerini zengin klinik bilgilerle incelemelerinin ve nüfusa dayalı kanser çalışmalarını büyük ölçüde geliştirmelerinin yolunu açmıştır.
