Bu protokolün kullanımı ile araştırmacılar ileri prostat kanseri için yeni eksom veya ekstrasellüler vezikül bazlı ve doku bazlı mikro hücresel belirleyebilirsiniz. RNA'yı hem F-F-B dokularından hem de hücre dışı veziküllerden izole etmek genellikle zor bir durumdur, çünkü çoğu de yaratılmıştır ya da sınırlı miktarda dır Bu parçacık, yeni nesil sıralama için en spesifik serbest ve yüksek kaliteli verileri genleştirmek için R-N-A girdileri ve C-D-N-A kitaplıklarını optimize etmek için farklı yöntemler üzerinde ayrıntılı olacaktır. Sonraki gen dizilişi tümör progresyonunun altında yatan tümörmolekül değişimini anlamak için en kapsamlı platformu sunar bu parçacık prostat kanseri klinik örneği ile optimize edilir ve ileri agresif prostat kanserinin altta yatan biyolojisi hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.
C-D-N-A kitaplıklarının düşük giriş li malzemeden optimize etmek, başarılı bir sıralama çalışması için çok önemli bir adımdır ve bu nedenle doğru sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli C-D-N-A kitaplıkları oluşturmak çok önemlidir. Daha önce yapılan gibi dokuların mikro diseksiyon yaptıktan sonra dört santigrat derece hasta serum örneklerinin serum türetilmiş E-V's Çözülme satırları izole devam edin. 110 mikro litre çözülmüş serum örneğini bir tüpe aktarın ve otuz dakika boyunca iki bin kez G'de döndürün.
Sonraki E-V veya ekzozom izolasyon için süper naden seçin ve debree pelet atın. Süper natent için serum ekzozom izolasyon reaktif30 mikroleter at. 30 dakika boyunca 4 derece lik bir kuluçka.
On dakika boyunca on bin kez G spin. Ayrı bir 1,5 mililitrelik tüp pelet rahatsız etmeden dikkatle E-V süper nadent seçin ve gelecekteki analiz için eksi 80 derece santigrat saklayın. Daha sonra çekirdeksiz suda hazırlanan 70 mikro p-b-s'lik E-V peletini yeniden askıya alın.
Mikro diseksiyon dokulardan toplam R-N-A izole sonra, ve saflaştırılmış E-V ticari kitleri kullanarak üç asal adaptör bir mikro litre de mikro litre R-N-A örnek başına normalleştirilmiş kırk nanogram beş mikro litre içine Kütüphane Hazırlama gerçekleştirmek. Termal döngüciyi 70 dereceye ısıtın ve numuneyi iki dakika kuluçkaya yatırın. Örnekleri hemen buza aktarın.
Ayrı bir tüp karışımı ligasyon tampon iki mikro litre, RNase inhibitörü bir mikro litre ve T4 RNA ligaz iki bir mikro litre, bir silme mutant. Mix bye pasta yukarı ve aşağı yatak. Daha sonra buz üzerinde R-N-A 3 prime adaptörü ile tüp karışımı dört mikro litre ekleyin.
Termal döngücörü önceden 28 dereceye ısıtın. Ve tüpü termal döngüye yerleştirip bir saat kuluçkaya yatın. Bundan sonra, termal döngü üzerinde örnek tutarken tüp içine stop çözeltisi bir mikro litre ekleyin.
28 derecede 15 dakika daha kuluçkaya yat. Sonra hemen tüp çıkarın ve buz üzerinde tutmak. Ayrı bir tüp beş asal adaptör bir mikrolitre ekleyin.
Önceden ısıtılmış bir ısı döngüsüne transfer. Ve iki dakika kuluçkaya yat. Adaptörlerin yeniden anneolaling önlemek için hemen buz üzerine tüp yerleştirin.
D tabiatlı beş ana adaptör tüpüne on milimole A-T-P bir mikro litre ekleyin. Mix bye pasta pedding ve karışımıtmak için T4 R-N-A ligaz bir mikro litre ekleyin. Mix bye pasta pedding.
Bu karışımın üç mikrolitresini, üç ana adaptör içeren tüpe aktarın. Tüpü önceden 28 dereceye kadar ısıtılan termal döngüye yerleştirin ve bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. Bundan sonra hemen buz üzerine tüp aktarın ve ya örnekler ile daha fazla devam veya eksi 80 santigrat derece gelecekte kullanım için saklayın.
R-T-P-C-R gerçekleştirmek için, her adaptör den altı mikro elendir r-n-a ligated kullanın ve r-n-A R-T astar bir mikro liger ekleyin. Tüpü önceden ısıtılmış ısıl döngüce 70 santigrat dereceye aktarın ve iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü buza aktarın.
Ayrı bir tüp karışımı 5X iki mikro litre, ipliktampon, 12.5 milimoler DNTP 5 mikro litre, 100 milimolar DTT bir mikro litre, R-N-A inhibitörü bir mikro litre, ve ters transkriptaz bir mikro litre. Adaptör e bu karışımın beş mikrolitre siperratör ligated RNA ekleyin ve bir saat boyunca kuluçka için 50 santigrat derece önceden ısıtılmış olan termal döngücün aktarın. Bir saat sonra adaptör hemen buz için ücretsiz DNA ligated transfer.
Ayrı bir tüpte, 25 mikrolitre PCR karışımı, iki mikro litre RNA PCR astar, iki mikro litre RNA PCR astar indeksi ve 8,5 mikrolitre RNA'nın serbest suyunu karıştırın. Adaptör ligated CDNA 12,5 mikrolitre bu karışımın 37,5 mikrolitre ekleyin. Tüpü önceden ısıtılmış olan termal döngüye aktarın.
Termal çevrimciyi üreticiprotokolünde önerildiği gibi döngü numarası 15 olarak değiştirildiğinde programla. Tamamlandıktan sonra, numuneyi dört derece santigrat derecede tutun. İleride kullanmak için eksi 80 santigrat derece de devam edin veya saklayın.
Ligated ücretsiz DNA arındırmak için, her ücretsiz DNA örneği için DNA yükleme boya on mikrolitre ekleyin. Ve yüksek çözünürlüklü ikinci ve özel RNA ikinci on mikrolitre. Her numunenin 30 mikrolitresini birbirine bitişik iki ayrı şeritte yüzde altı TBE Poliakrilamid jelde çalıştırın.
Özel RNA ikinci ve yüksek çözünürlüklü ikinci ile, iki farklı örnek arasındaki ara boşluk. Yaklaşık 30 ila 40 dakika boyunca 145 volt bir X TBE tampon jel çalıştırın. Yükleme boyasının alt mavi ön kısmını takip edin.
Jelin dibine yaklaştığında elektroforezi durdurun. Milimetre ethidium bromür başına 5 mikrogram ile bir X TBE tampon jel aktarın. Jeli bir transilluminator'da görselleştirin ve adaptör dimer ile kontaminasyonu önlemek için jeli tam olarak 145 baz çifti ve 160 baz çifti belirteçleri arasında ve 145 baz çifti belirteci arasında kesin olarak kesin olarak kesin.
Adaptör dimerleri istenilen markaya çok yenik sayılsa da jelin tam olarak kesilmesiyle yapılan saflaştırma ligatlı CDNA'dır. Jel parçalarını iki milimetrelik toplama tüplerinde tutulan DNA kırma tüplerine aktarın. İki dakika boyunca 20 bin kez G'de dön.
Ve rNase içermeyen su üç yüz mikro litre ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede bir rocker üzerinde yavaşça döndürmek için izin. Ertesi gün DNA çökeltisi gerçekleştirmek için tüpün içeriğini 5 mikron filtre tüpüne aktarın. 600 kez G'yi 10 saniye boyunca döndürün.
Sonra üç molar sodyum asetat glikojen otuz mikrolitre iki mikrolitre ekleyin, 1X pelet boya, ve 975 mikrolitre 100 yüzde etanol eluted DNA. 17,000 kez G'de 4 santigrat derecede 20 dakika dön. Supernatant atın ve pelet yıkamak için yüzde 75 etanol ekleyin.
17.000 g dört derece santigrat beş dakika döndükten sonra supernatant atın ve bir termal blok üzerinde 37 santigrat derece tüpler inkübün tamamen etanol buharlaşır. Ph 8.5'te 10 milimoler trikte klorür 12 mikrolitre ile pelet askıya alın. Daha sonra saflaştırılmış ve ücretsiz DNA'yı on kez seyrelterek ve bir biyoanalizörüzerinde çalıştırmak için seyreltilmiş CDNA'nın bir mikrolitresini kullanarak kütüphane kalite kontrolü yapın.
Ücretsiz DNA ürün boyutunun elektroperogramdaki küçük RNA'nın 136 ile 160 baz çifti arasındaki aralığına karşılık gelen denemin. Her örnek için toplam azı lılığını hesaplayın. PH 8.5'teki tris hidroklorür kullanarak her numuneyi 2 nanomolara normalleştirin.
Kütüphaneleri, her iki nanomolar numunenin eşit hacimlerini tek bir iki yüz mikrolitrelik PCR tüpte karıştırarak tutun. Detabiat ve sıra, el yazmasında açıklandığı gibi adımları takip eder. Bu çalışmada kütüphane RNA izolasyonu sonrası hazırlanarak kalite kontrolü yapılmıştır.
Adaptör ligated mikro Rnase için ürün boyutu her örnek için yaklaşık 136 ila 160 baz çiftleri karşılık gelir. Vurgulanan bölümler, küçük RNA hazırlık kütüphanesi için hassas bir şekilde uyarılmış jelin aralığını gösterir. Bu şekil, saflaştırılmış ücretsiz DNA kütüphanesi için jel elektroforez ve elektroferogramları göstermektedir.
Mikro diseksiyonlu FFPE dokusu ve serum ev kaynaklı. Küçük bir RNA sıralama çalışmasından elde edilen temsili ölçümler, beklenen küme yoğunluğunu, Q skoru, küme geçme filtre yüzdesini ve mikro parçalanmış FFP dokusu ve serum dan elde edilen EV'ler için tahmini verim ve hata oranlarını gösterir. Her iki örnekteki Q skoru, temel çağrı doğruluğunun yüzde 99,9'unu gösteren üç değerin üzerinde bir değer gösterdi.
Ve hata oranları nın hepsi birin altındaydı. Kütüphane hazırlığındaki her adım dikkatle yürütülmeli ve tüpler her kuluçkadan sonra hemen buza aktarılmalıdır. Protokoldeki kritik bir adım, adaptör dimer ücretsiz ve saf CDNA kitaplığı olduğundan emin olmak için jeli tam olarak kesmektir.
CDNA kitaplığı oluşturmak, yüksek kaliteli sıralama çalışması için optimizasyon gerektirir. Bu protokolü anlamak, izleyicilerin bu dakika ayrıntılarını sınırlı kaynak örneklerinden diğer sıralama kitaplık preprasyonuna ekstrapolating de yardımcı olacaktır serum ve hücre dışı veziküller öneririz. Bu teknik, metastatik prostat kanseri hastalarında tümörat agresifliği ve tedavi direnci ile ilişkili yeni mikronazın belirlenmesinde bize yardımcı olmuştur.
Bu teknikler Roman biyomarker keşfiyardımcı olabilir diğer hastalık tipleri için tahmin edilebilir. Bu teknik, striation derived serum ve doku örnekleri gibi biyolojik malzemeler kullandığından, gerekli önlemler alınmalıdır. Ayrıca, ethidyum bromür bilinen bir karsinojendir ve bu protokol kullanılarak çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
