Bu protokol, bireysel nanotüplerin ana vezikülünkine benzer faz ayırma davranışı sergilediği büyük ölçekli lipit nanotüp ağlarının basit bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, lipit nanotüplerini son derece paralel bir şekilde ve insan müdahalesi olmadan kendi kendine monte etmek için moleküler motorlar tarafından yapılan çalışmaları benimsememizdir. Bir kayma hareketliliği testi oluşturmak için, ilk olarak, beş milimetre arayla bir cam slayt üzerine üç set çift taraflı bant şeridi yapıştırın.
Bir kapak kaymasını bandın üzerine hafifçe bastırın ve hazırlanan akış hücresine 30 mikrolitre bir mikromolar kinesin çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra, hücreye 30 mikrolitre 10 mikrogram / mililitre mikrotübül çözeltisi ekleyin ve çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırarak bir laboratuvar mendili bastırın. Beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, akış hücresine 30 mikrolitre 10 mikrogram / mililitre streptavidin çözeltisi eklemeden önce hücreyi yıkama başına 50 mikrolitre oda sıcaklığında hareketlilik çözeltisi ile bir ila üç kez yıkayın.
10 dakika sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için 30 mikrolitre 10X GUV çözeltisi ekleyin. Ardından, 100 milimolar AMP-PNP çözeltisinin iki mikrolitresini ekleyin ve odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Akış odasını görüntüleme için ters çevrilmiş bir mikroskopa aktarın ve uygun filtre setini seçin.
İlgilenilen bir ağın görüntüsünü elde etmeden önce kapak kaymasının yüzeyine odaklanmak için 100X yağ hedefi kullanın. Ardından görüntüyü ImageJ'de açın ve bileşik görüntü oluşturmak üzere kırmızı ve yeşil kanalları kaplamak için Görüntü, Renk ve Kompozit'i tıklatın. Görüntülemeden sonra, ilgilendiğiniz görüntüyü açın ve mikroskop için ölçeği kalibre etmek üzere Analiz Et ve Ölçeği ayarla'yı tıklatın.
Pikselleri mikrometre dönüşüm faktörüne doldurun ve Tamam'ı tıklayın. Ana GUV'den başlayan nanotüpleri izlemek için çok noktalı çizgi aracını kullanın ve uzunluğu ölçmek için Control ve M tuşlarını basılı tutun. Görüntü işleme aracı, her yeni ölçümü sonuçlar penceresine kaydeder. Tüm tüpler ölçüldüğünde, Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin ve eşiği uygulamak için Uygula'yı tıklayın.
Ardından, istenen tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin. Alanın tümleşik yoğunluğunu ölçmek için, Analiz Et ve Ölç'ü tıklatın Sıvı nanotüp düğümlerindeki lipit bölümlemesini belirlemek için, ilgili düğüm üzerine bir çizgi çizmek ve hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki düğüm yoğunluğunu ölçmek için çizgi aracını kullanın. Bu temsili analizde, sıvı nanotüp ağları, sıvı düzensiz ve düzenli fazların yanı sıra fazdan ayrılmış veziküller üretmek için gösterildiği gibi üretildi.
Örneğin,% 45 doymuş lipit ve% 55 doymamış lipit ile sentezlenen veziküller, birlikte var olan sıvı düzensiz ve katı fazlara ayrılan veziküllerle sonuçlanır. Bununla birlikte, kolesterol dahil edilirse, sıvı-sıvı bir arada bulunabilir ve birlikte var olan sıvı sıralı ve sıvı düzensiz fazlara ayrılan GUV'lar yaratılabilir. Ayrıca, fazdan ayrılmış karışımlar içinde düğümler gözlemlenebilir.
Hatırlanması gereken en önemli şey, floroforları foto-ağartmadan lipit nanotüplerini görselleştirebilmek için uygun pozlama süresini ve ND filtresini seçmektir. Lipid nanotüplerinin faz davranışının bileşimini uyarlamak, hücreleri birbirine bağlayan tünelleme nanotüplerinin biyofiziğini incelemeye başlamak için minimalist bir model sistemi kullanmamızı sağlar.
