ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

פרוטוקול זה מאפשר יצירה פשוטה של רשתות ננו-צינוריות ליפידיות בקנה מידה גדול שבהן הננו-צינוריות הבודדות מציגות התנהגות הפרדת פאזות דומה לזו של שלפוחית האב. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שאנו בוחרים במשותף את העבודה שנעשתה על ידי המנועים המולקולריים כדי להרכיב את עצמן של הננו-צינוריות השומנים באופן מקביל ביותר וללא התערבות אנושית. כדי להגדיר בדיקת תנועתיות גלישה, ראשית, הצמידו שלושה סטים של רצועות סרט דו-צדדיות על מגלשת זכוכית במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה.

לחץ בעדינות על החלקת כיסוי על הקלטת והוסף 30 מיקרוליטרים של תמיסת קינסין של מיקרומולר אחד לתוך תא הזרימה המוכן. לאחר חמש דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת מיקרוטובול של 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתוך התא, תוך לחיצה על מגבון מעבדה בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי התמיסות. לאחר דגירה נוספת של חמש דקות, שטפו את התא פעם עד שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטרים של תמיסת תנועתיות בטמפרטורת החדר לכל שטיפה לפני שתוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת סטרפטווידין 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתא הזרימה.

לאחר 10 דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת GUV 10X לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת AMP-PNP של 100 מילימולרי וסגרו את התא עם חומר איטום. העבר את תא הזרימה למיקרוסקופ הפוך להדמיה ובחר את ערכת המסנן המתאימה.

השתמש במטרת שמן 100X כדי למקד תחילה את פני השטח של החלקת הכיסוי לפני שתרכוש תמונה של רשת מעניינת. לאחר מכן פתחו את התמונה ב-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'צבע' ו'קומפוזיט' כדי לכסות את הערוצים האדומים והירוקים כדי ליצור תמונה מורכבת. לאחר ההדמיה, פתח את התמונה המעניינת ולחץ על נתח והגדר קנה מידה כדי לכייל את קנה המידה עבור המיקרוסקופ.

מלא את הפיקסלים למקדם ההמרה של המיקרומטר ולחץ על אישור. השתמש בכלי הקו הרב-נקודתי כדי לעקוב אחר הננו-צינוריות החל מ-GUV האב ולחץ והחזק את Control ו-M כדי למדוד את האורך. כלי עיבוד התמונה ישמור כל מדידה חדשה בחלון התוצאות. לאחר שנמדדו כל הצינורות, בחר תמונה, כוונן וסף ולחץ על החל כדי להחיל את הסף.

לאחר מכן, ציירו מלבן באורך ידוע מעל הצינור הרצוי. כדי למדוד את הצפיפות המשולבת של האזור, לחץ על נתח ומדוד כדי לקבוע את חלוקת השומנים בצמתי הננו-צינוריות הנוזליות, השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו מעל צומת העניין ולמדוד את עוצמת הצומת הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים. בניתוח מייצג זה, רשתות ננו-צינוריות נוזליות יוצרו כפי שהוכח כי הן יוצרות פאזות עם הפרעות נוזלים וסודרות, כמו גם שלפוחיות מופרדות פאזה.

לדוגמה, שלפוחיות המסונתזות עם 45% שומנים רוויים ו-55% שומנים בלתי רוויים גורמות לשלפוחיות המפרידות לפאזות דו-קיום של הפרעות נוזליות ומוצקות. עם זאת, אם הכולסטרול נכלל, ניתן להבחין בדו-קיום נוזלי-נוזלי, מה שיוצר GUVs המפרידים לשלבים דו-קיום של סידור נוזלי והפרעות נוזליות. יתר על כן, צמתים ניתן לראות בתוך תערובות מופרדות פאזה.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לבחור את זמן החשיפה המתאים ואת סט המסנן ND כדי להיות מסוגל לדמיין את הננו-צינוריות השומנים מבלי להלבין את הפלואורופורים. התאמת הרכב התנהגות הפאזה של הננו-צינוריות השומנים מאפשרת לנו להשתמש במערכת מודל מינימליסטית כדי להתחיל לחקור את הביופיזיקה של הננו-צינוריות המתעלות המחברות תאים.