Ce protocole permet la génération simple de réseaux de nanotubes lipidiques à grande échelle dans lesquels les nanotubes individuels présentent un comportement de séparation de phase similaire à celui de la vésicule parente. Le principal avantage de cette approche est que nous cooptons le travail effectué par les moteurs moléculaires pour auto-assembler les nanotubes lipidiques de manière très parallèle et sans intervention humaine. Pour mettre en place un test de motilité de glissement, fixez d’abord trois ensembles de bandes de ruban adhésif double face sur une glissière de verre espacée de cinq millimètres.
Appuyez doucement sur un couvercle et ajoutez 30 microlitres d’une solution de kinésine monomolaire dans la cellule d’écoulement préparée. Après cinq minutes, ajouter 30 microlitres d’une solution de microtubules de 10 microgrammes /millilitres dans la cellule, en appuyant doucement sur une lingette de laboratoire contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Après une autre incubation de cinq minutes, lavez la cellule une à trois fois avec 50 microlitres de solution de motilité à température ambiante par lavage avant d’ajouter 30 microlitres de solution de streptavidine de 10 microgrammes / millilitres à la cellule d’écoulement.
Après 10 minutes, ajouter 30 microlitres d’une solution GUV 10X pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’une solution AMP-PNP de 100 millimolaires et fermez la chambre avec du scellant. Transférez la chambre d’écoulement dans un microscope inversé pour l’imagerie et sélectionnez le jeu de filtres approprié.
Utilisez un objectif d’huile 100X pour focaliser d’abord la surface du couvercle avant d’acquérir une image d’un réseau d’intérêt. Ouvrez ensuite l’image dans ImageJ et cliquez sur Image, Couleur et Composite pour superposer les couches rouge et verte afin de créer une image composite. Après l’imagerie, ouvrez l’image qui vous intéresse et cliquez sur Analyser et définir l’échelle pour calibrer l’échelle du microscope.
Remplissez les pixels au facteur de conversion du micromètre et cliquez sur OK. Utilisez l’outil de ligne multipoint pour tracer les nanotubes à partir du GUV parent et maintenez enfoncés Ctrl et M pour mesurer la longueur. L’outil de traitement d’image enregistrera chaque nouvelle mesure dans la fenêtre de résultats. Lorsque tous les tubes ont été mesurés, sélectionnez Image, Ajuster et Seuil, puis cliquez sur Appliquer pour appliquer le seuil.
Ensuite, dessinez un rectangle de longueur connue sur le tube souhaité. Pour mesurer la densité intégrée de la zone, cliquez sur Analyser et mesurer Pour déterminer la partition des lipides dans les nœuds de nanotubes liquides, utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur le nœud d’intérêt et mesurer l’intensité du nœud dans les canaux vert et rouge. Dans cette analyse représentative, des réseaux de nanotubes liquides ont été fabriqués pour générer des phases désordonnées et ordonnées par des liquides, ainsi que des vésicules séparées par phase.
Par exemple, les vésicules synthétisées avec 45% de lipides saturés et 55% de lipides insaturés donnent des vésicules qui se séparent en phases coexistantes désordonnées liquides et solides. Si le cholestérol est inclus, cependant, la coexistence liquide-liquide peut alors être observée, créant des GUV qui se séparent en phases coexistantes d’ordre liquide et de désordre liquide. De plus, des nœuds peuvent être observés dans les mélanges séparés par phase.
La chose la plus importante à retenir est de choisir le temps d’exposition approprié et le jeu de filtres ND pour pouvoir visualiser les nanotubes lipidiques sans photo-blanchiment des fluorophores. L’adaptation de la composition du comportement de phase des nanotubes lipidiques nous permet d’utiliser un système de modèle minimaliste pour commencer à étudier la biophysique des nanotubes à effet tunnel qui relient les cellules.
