Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.

HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.
1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi
<ol><li>Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı test<ol>
<li>Tüm deneyler için 20'den az pasajlı yeni çözülmüş hücreler kullanın. 1. günde, standart bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin ve Trypan mavi dışlama yöntemi13'ü kullanarak toplam uygulanabilir hücreleri sayın.</li>
		<li>2 mL standart büyüme ortamında kuyu başına 0,9 - 1,2 x 10 6 HEK 293 hücreli tohum6 kuyu plakaları. NOT: Yukarıda belirtilen hücre hatları içinde en iyi transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, kaplamalı hücrelerin tohumlamadan sonraki gün% 70-90 birleştiğinden emin olun.</li>
		<li>2. günün sabahında, suba-eIF4E ve eIF4G604-646-SubB plazmid ile birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak hücrelerin eş transfectleri (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>9 μL lipozom bazlı çözeltiyi fenol kırmızısı olmadan 125 μL azaltılmış serum ortamı içeren bir tüpte seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu)her transfeksiyon için ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Her transfeksiyon tüpü için 125 μL azaltılmış serum ortamında her plazmidden 3 μg seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın.</li>
			<li>DNA ana karışım tüpüne 12 μL arttırıcı reaktif ekleyin, iyice karıştırın ve hemen DNA'yı ekleyin: seyreltilmiş lipozomların her tüpüne 1:1 oranında arttırıcı ana karışımı. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
			<li>DNA lipid kompleksini her kuyuya ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3. günün sabahında, her birini 1 mL PBS ile iyice durulayın.</li>
		<li>PBS'yi çıkarın ve her kuyudaki hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca 0,3 mL tripsin ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Her kuyuya % 0 FCS içeren fenol kırmızısı içermeyen azaltılmış serum ortamının 2 mL'sini ekleyerek trypsin'i nötralize edin ve transfected hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: Fenol kırmızısı luciferaz aktivitesini engelleyebilir; bu nedenle, hücreler bu adımdan itibaren fenol kırmızısı olmadan ortamda ele alınmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri 290 x g'da 5 dakika döndürün ve ortamı aspire edin. Hücreleri% 0 FCS içeren fenol kırmızısı olmadan azaltılmış serum ortamının 2 mL'sinde yeniden kullanın. Adım 1.1'de açıklandığı gibi sayın.</li>
		<li>Tohum, %0 FCS içeren fenol kırmızısı olmayan 90 μL orta alanda kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyu opak plakada HEK 293 hücrelerini trans enfekte etti. 3 farklı bileşik için aynı deneyde 3 teknik çoğaltma elde etmek için, kenarlardaki kuyular hariç hücrelere sahip plakaların tohum 60 kuyusu.</li>
		<li>Transfected hücreleri tohumlamadan hemen sonra, % 10 DMSO bileşik çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik hazırlama<ol>
<li>Faiz bileşiği %100 DMSO 'da (v/v) eriterek 1 mM bileşik stok çözümleri hazırlayın. Her bileşik titrasyon için 3 çoğaltmaya sahip olmak için, 1 mM bileşik stok çözeltisinin 8 μL'sini kullanın. NOT: Kullanılan 1 mM stok bileşiği hacmi ihtiyaç duyulandan daha fazladır. Bu, varsa pipetleme hatalarını dikkate almak için yapılır.</li>
		<li>Stok bileşik çözeltisinin 2 kat seri seyreltilmesini, 1 mM'lik stoğun 4 μL'si ile her titrasyon noktası için % 100 DMSO'nun 4 μL'sine gerçekleştirin. NOT: Tam bir bileşik titrasyon için başlangıç stoğundan %100 DMSO'da 9 seri seyreltme gerçekleştirin. Birden fazla bileşiğin test edilmesi gerekiyorsa, bu adımı ve sonraki seyreltmeleri kolaylaştırmak için bir 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>%10 DMSO (v/v) (v/v) içinde 40 μL 10x çalışma çözümleri hazırlamak için 2 kat seri seyreltmenin her noktası için 36 μL HPLC sınıfı steril su ekleyin. 100 μM ila 0,39 μM %10 DMSO stok serisi, hücrelere eklendiğinde %1 DMSO'da 10 μM ila 0,039 μM arasında nihai bir çözüme yol açacaktır. Arıtma kontrolüne gelince, HPLC sınıfı steril suda% 10 DMSO sadece stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Toplam 100 μL hacimde% 1 (v / v) kalıntı DMSO konsantrasyonu ile hedeflenen son konsantrasyonu elde etmek için 96 kuyu opak plakasındaki hücrelere 10 μL 10x çalışma çözeltisi ekleyin ve% 5 v / v atmosferik CO2ile 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Luciferaz kompleasyonu ve uygulanabilirlik tahlilleri<ol>
<li>3 saat ilaçlamadan sonra, 1 hacimli substratı seyreltme reaktifinin 19 hacmiyle birleştirerek luciferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın (üreticinin talimatlarına bakın). NOT: Luciferaz tahlili, piyasada bulunan bir kit kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Hemen 25 μL substrat reaktif eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
		<li>Plakayı oda sıcaklığında yörüngesel bir çalkalayıcıda 50 dakika boyunca 350 rpm'de sallayın.</li>
		<li>Plaka okuyucu kullanarak lüminesansı değerlendirin. Bunu yapmak için ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın.</li>
		<li>Hücre canlılığını yok etmek için, 33 μL canlılık tahlil reaktifi ekleyin ve plaka okuyucuyu kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sonra lüminesansı tekrar ölçün.</li>
		<li>Ayna okuyucuyu Lüminesans'a ve emisyon filtresini 600 nm'ye ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın. NOT: Uygulanabilirlik, üretici talimatlarına göre hücre içi ATP seviyesi hücre içi liziz üzerinde ölçülerek değerlendirilir. Bu durumda çoklama mümkündür, çünkü canlı test farklı bir emisyon dalga boyunda farklı bir luciferaz kullanır.</li>
		<li>Verileri 4 parametreli sığdırma eğrisi denklemine sığdırarak her bileşiğin IC50 değerlerini belirlemek için verileri kullanın: Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D D ve A sayısal değerleri eğri sığdırma işleminde kısıtlanmalıdır: D = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen minimum eğri asemptot veya minimum teorik yanıt seviyesi için Y eksenindeki parlak değer. A = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen maksimal eğri asemptot veya maksimal teorik seviye yanıtı için Y ekseninde parlaklık değeri. NOT: Minimum yanıtın değeri %1 DMSO (v/v) kontrol tedavisinden, maksimum yanıtın değeri ise hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan yüksek benzeşimli mTOR inhibitörünün maksimum tepkisinden elde edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. eIF4E:eIF4G604-646 tahlil inhibisyonunu hücrelerde eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilendiren
<ol><li>Test tarafından ölçülen sinyalin, 1.1 adımında açıklandığı gibi, bileşik, tohum hücreleri tarafından eIF4E-eIF4G etkileşiminin fiziksel bozulmasına karşılık geldiğini onaylamak için.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı fenol kırmızısı içermeyen 1 mL azaltılmış serum ortamı ile değiştirin ve ilgi bileşiği ile 4 saat kuluçkaya yatırın. Toplam 1 mL hacimde %1 (v/v) kalıntı DMSO konsantrasyonu sağlayın. NOT: Sonuçla kolayca bir korelasyona izin vermek için, ölçülen tamamlayıcı test titrasyon eğrisinin başında, orta noktasında ve uç noktasında bileşik konsantrasyonlar kullanın.</li>
	<li>EIF4F ve eIF4E:4EBP1 komplekslerini izole etmek için Lyse hücreleri ve gerçekleştirilen m7GTP aşağı çekme. m7GTP aşağı çekme deneyinin nasıl gerçekleştirileceğine dair ayrıntılı prosedürler başka bir yerde bulunabilir14.</li>
	<li>Batı blot analizi ile m7GTP bağlı eIF4G, eIF4E ve 4EBP1 protein seviyelerini tespit edin ve ardından tamamlayıcı test sinyali inhibisyonu ile eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu makalede açıklanan deneysel kurulum 96 kuyu mikro plaka formatı kullanımı için tasarlanmıştır.
En iyi sonuçlar için, tahlil yapılırken iki kritik adım göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, deneyler arasındaki transfeksiyon verimliliği benzer kalmalıdır. Bu, düşük geçişli sayı hücrelerinin kullanılması ve tohumlama gününde hücrelerin titizlikle sayılmasıyla sağlanabilir. Hücre konfeksiyoni% 70-90'dan azsa lipid bazlı transfeksiyon reaktifi olan hücrelerin transfection yapılması önerilmediğinden, DNA transfeksiyon yapılmadan önce hücre konfeksiyonları da değerlendirilmelidir. İkinci olarak, tamamlayıcı testini bir hücre canlılık tahliliyle çoklamak önemlidir. Bazı bileşikler öncelikle zararlı etkiler yoluyla canlı hücrelerin sayısını azaltarak luciferaz sinyalini etkileyebilir. Bu nedenle, hedef dışı ve spesifik olmayan etkileri ele almak için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı testten hemen sonra hücrenin canlılığını ölçmek önemlidir.
EIF4E ve eIF4G arasındaki gibi, hidrofobik yarıklardan yoksun, nispeten büyük ve düzlemci olan protein-protein arayüzleri, genellikle geleneksel küçük molekül terapötikleri (<500 MW)17tarafından "ilaçlanamaz" olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür yüzeylerle (örneğin makrosiklik ve peptidomimetik bileşikler) verimli bir şekilde etkileşime giren yeni modalitelerin gelişimine artan bir ilgi vardır. Bununla birlikte, bu yeni modalitelerin çoğu doğuştan hücre zarını geçemez ve hedeflerine saldıramaz. Bu sorunları atlatmak için, birçok araştırma grubu yeni kimyasal optimizasyon ve hücresel teslimat stratejileri üzerine araştırmalar yürütmektedir. eIF4E:eIF4G604-646 canlı hücre PPI tahlili ve diğer benzer ÜFE türevli tahlillerin bu stratejilerin geliştirilmesinde ve doğrulandırılmasında önemli bir rol oynayacağını öngörüyoruz.

Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.
Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın aktivasyon veya çeviri başlatma faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile nedensel olarak bağlantılıdır1.
eIF4F kompleksi, çeviri başlatmanın ana düzenleyicisidir. mRNA'ların 5' ucundaki kapak yapısını bağlayarak, eIF4F ilk mRNA-ribozom alımını yönlendiriyor ve buna karşılık zayıf çevrilmiş ökaryotikmRNA'larınmRNA çeviri verimliliğini artırıyor 2 . Kansere bağlı mRNA'ların eIF4F aracılı çevirisi, RAS / MAPK veya AKT / TOR yollarının anormal aktivasyonunu barındıran birçok kanser modeli için bildirilmiştir, bu da kanser hücrelerinin kendi neoplastik aktivitelerini artırmak için eIF4F'yi yükselttiğini göstermektedir. EIF4F karmaşık oluşumunu engelleyerek bu ilerleme döngüsünün bozulması, böylece çok umut verici bir terapötik stratejidir3,4.
eIF4F kompleksi (i) eIF4E, mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase ve (iii) eIF4G'nin 5' UTR'sinde bulunan kapak yapısıyla etkileşime giren eIF4F'nin kapak bağlama alt birliği, hem eIF4A hem de eIF4E ile etkileşime giren ve sonunda 40S ribozomal alt birliği5'iişe alan iskele proteini. eIF4E ile eIF4G ilişkisi fonksiyonel eIF4F komplekslerinin montajı için hız sınırlayıcı adımdır ve eIF4E bağlayıcı proteinler (4EBP'ler, üyeler 1, 2 ve 3)) tarafından olumsuz düzenlenir6. 4EBP, kurallı ve kurallı olmayan eIF4E bağlama dizileri7, 8,9'dan (insan eIF4E'de aa 604-646'yı kapsayan bölge) oluşan bir arayüz aracılığıyla eIF4E'ye eIF4G bağlama ile rekabet ederek, çeviride aktif olarak yer alan eIF4E havuzunu azaltır ve eIF4F karmaşık oluşumunu önler. Bu protein-protein etkileşimlerinin etkileşimi esas olarak 4EBP'nin rapamycin (mTOR) aracılı fosforilasyonunun memeli hedefi tarafından düzenlenir. Mitojenik uyaranlar üzerine, mTOR doğrudan 4E-BP protein ailesinin üyelerini fosforilize eder, eIF4E ile ilişkilerini azaltır ve böylece eIF4E-eIF4G etkileşimini ve fonksiyonel eIF4F komplekslerinin oluşumunu teşvikeder 10.
EIF4F karmaşık bütünlüğünü hedefleyen bileşikler geliştirmedeki büyük çabaya rağmen, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin doğrudan bozulmasını ölçen tahlillerin olmaması hücresel aktif isabet bileşiklerinin aranmasını sınırlamıştır. EIF4E-eIF4G etkileşimi yoluyla eIF4F bütünlüğünün durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir koelenterazin analoga (örneğin, Nanolüc tabanlı kompleasyon tahlili) dayanan bir luciferaz tahlil uyguladık. Luciferaz kompleasyon protein sistemi, minimum kendi kendine ilişki ve stabilite için optimize edilmiş 18 kDa protein parçası (SubA) ve 11 amino asit peptit parçasından (SubB) oluşur11. Bir kez insan tam uzunlukta eIF4E ve insan eiF4G1 (aa 604-646) eIF4E etkileşim etki alanı ile bir füzyon ürünü olarak ifade edildikten sonra, iki etkileşim proteini SubA ve SubB parçasını birbirlerinin yakınına getirecek ve aktif luciferaz oluşumunu teşvik edecektir, bir hücre geçirgen substratı varlığında, sonunda parlak bir parlaklık sinyali üretecektir (Şekil 1). EIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin16.
Burada, canlı hücrelerde 4EBP1 aracılı eIF4E-eIF4G bozulmasını doğru bir şekilde ölçmek için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı sisteminin (istek üzerine kullanılabilir) nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Ek olarak, şu anda klinik çalışmalar altında olan birkaç mTOR inhibitörünün etkilerini potansiyel kanser terapötik ilaçlar olarak ölçerek faydasını gösteriyoruz12. Hedef dışı etkiler genellikle ilaca özgü aktiviteyi maskelediğinden, eIF4E:eIF4G604-646 sistem ölçümünün çok yönlülüğünün, bunları dikkate almak için hücresel canlılığın ortogonal ölçümleriyle nasıl genişletilebileceğini de açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>293FT cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Cell titer Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>not applcable</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;L3000015&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Eppendorf</td><td>not appicable</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP (C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.

eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allosterik inhibitörleri olan ancak mTORC2 ve ATP rekabetçi tabanlı inhibitörler (örneğin, PP242) hem mTORC1 hem de mTORC2 kinaz katalitik aktivitesini inhibe etmek için tasarlanmış rapaloglar (örneğin, Rapamycin).
HEK293 hücreleri, adım 1'de açıklandığı gibi eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemi ile transkred edildi. 24 saatlik transfeksiyondan sonra hücreler mTOR inhibitörleri PP242 ve rapamycin ile yeniden tohumlandı ve tedavi edildi (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Tedaviden dört saat sonra, daha önce açıklandığı gibi lüminesans değerlendirildi ve ardından hücre canlılığı yapıldı. Şekil 2'degösterildiği gibi, PP242, 0,72 ± 0,04 μM'lik hesaplanmış bir IC50 ile sinyalin doza bağımlı bir inhibisyonunu üretirken, rapamycin için 6,88 ± 0,88 μM'lik bir IC50 türetilir (Şekil 2A). Plakalar daha sonra hücresel canlılık tahlilleri için çoklanmıştır(Şekil 2D). Bu analiz, ne PP242'nin ne de rapamycin'in hücre canlılığında önemli bir azalma yaratmadığını ve eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemindeki lüminesanstaki azalmanın spesifik olmayan hücre ölümünden değil, eIF4E:4G etkileşiminin bozulmasından kaynaklandığını göstermektedir.
Bir m7GTP çekme deneyi, ilkeye karşılık gelen bileşik konsantrasyonlarla enfekte olmayan hücreleri inkübe ederek gerçekleştirilir, Şekil2'de ölçülen titrasyon eğrisinin orta ve uç noktaları,endojen eIF4E-eIF4G etkileşiminin 4EBP1 aracılı bozulmasının ölçülen eIF4E:eIF4G604-646 tahlil sinyaliyle ilişkili olduğunu göstermektedir (Şekil 2B, 2C). Bu sonuçlarla tutarlı olarak, PP242'nin HEK 293 hücrelerinde test edilen deneysel koşullar altında toplam 4EBP1 fosforilasyonun rapamycin'den daha güçlü bir inhibitörü olduğu gösterilmiştir (Şekil 3A), her iki inhibitör de mTOR sinyaline normal etki gösterirken, rapamycin mTORC1 substratlarına ve PP242'ye karşı daha aktif olmasıyla hem mTORC1 hem de mTORC2'yi hedef alan ( Şekil3B).
Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PP242'nin HEK293 hücrelerindeki rapamycin'den daha fazla eIF4F karmaşık oluşumunu bozmada daha etkili olduğunu ve eIF4E:eIF4G604-646 sisteminin canlı hücrelerde eIF4F karmaşık montajını doğru bir şekilde ölçebileceğini göstermiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> Şekil 1: eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemi. X (eIF4E) ve protein Y (eIF4G604-646)etkileşiminin SubA ve SubB füzyonlarının birbirleriyle yakınlaşmasını ve aktif luciferazı yeniden oluşturmasını nasıl sağladığını gösteren şematik gösterim. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> Şekil 2: eIF4F kompleksinin 4EBP1 aracılı bozulması. (A) PP242 ve rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 tahlil titrasyonu transfected HEK 293 hücrelerinde eIF4E ve eIF4G arasındaki etkileşimi modeller. (B,C) HEK 293 ekstraktlarında ve m7GTP'de sırasıyla pp242 veya Rapamycin konsantrasyonu farklı olan kültürlü hücrelerin inkübasyonundan sonra aşağı çekmekte olan endojen eIF4E, eIF4G ve 4EBP1 seviyesini gösteren Batı blot analizi. (D) Hücre canlılığı ve lüminesans için çoklanmış hücrelerin değerlendirildiği A'da tedavi edildi. Tüm değerler ortalama ± SD'± temsil eder (n=3). Bu rakam16'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> Şekil 3: mTOR inhibisyonunun 4EBP1 fosforilasyon üzerindeki diferansiyel etkisi. (A) PP242 ve rapamycin konsantrasyonu ile tedavi edilen trans enfekte olmayan HEK293 hücrelerinde 4EBP1 fosforilasyon durumunun Batı blot analizi. (B) Çift MTORC1/2 aktif saha inhibitörü PP242 veya mTORC1 Rapamycin allosterik inhibitörü ile tedavi edilen transktasyonsuz HEK293 hücrelerinde AKT ve S6 fosforilasyon durumunun Batı blot analizi. Beta actin, toplam 4EBP1, AKT ve S6'nın yanı sıra yükleme kontrolü için görselleştirildi. Bu rakam16'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Görüntüleme.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Video: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genetik

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Biyokimya

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biyoloji

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...