Name: analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions at JoVE.com

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.

Hücre Kültürü 1. Hazırlıklar <ol><li> insan hücrelerinin ticari olarak temin stoklarının al. NOT: Bu protokol, HCT116 kolon karsinomu ve birincil insan renal proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (HRPTEC) kullanır. </li><li> Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 7.5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş / yüksek glukoz ortamı: HCT116 kültürü için 500 mi tanesidir. </li><li> % 5 FBS,% 1 epitel hücre büyüme takviyesi ile takviye Epitelyal hücre ortamı, ve% 1 P / S: 500 mi HRPTEC kültürü için tanesidir. </li><li> 140 mM NaCI, 3 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4: 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 500 ml hazırlayın. 7.4 pH ayarlamak ve 121 ° C&#39;de 40 dakika süre ile otoklavlama sureti ile sterilize. </li></ol> Hücre kültürü 2. Başlatma <ol><li> Dikkatle t bozmadan% 80-90 konfluent çanak orta aspireO hücreleri. </li><li> kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın. </li><li> 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yıkanır ve hafifçe eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelere kaya kısım. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 90 sn için 4000 xg, 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü ve santrifüje müstakil hücreleri aktarın. </li><li> tam DMEM 1 ml tekrar süspansiyon hücre pelet. </li><li> bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Cm2 başına yaklaşık 2,500-5,000 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu elde etmek için gereken kaç pirojenik olmayan ve polistiren 100 mm&#39;lik bir hücre kültür kaplarına hesaplayın. </li><li> adım 30-45 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1.2 veya 1.3 yapılan ön sıcak tam hücre kültürü ortamı. </li><li> % 70 etanol ile orta şişe ve hücre şişesini dekontamine. ileriye bu noktadan itibarenişlemler aseptik olarak yapılmalıdır. </li><li> Kısım adım 2.6 belirtilen tohum ekme yoğunluğu olan dondurulmuş hücre, tüm birimi kullanmak, çok 100 mm hücre kültür kaplarına tam DMEM 6 mi. </li><li> 100 mm kültür çanakları her adım 2.6 hesaplanan hücre süspansiyonu hacmi aktarın. eşit plaka yüzeyi üzerinde hücreleri dağıtmak için elle her plakayı sallayın. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübatörde tohumlanmış 100 mm hücre kültür çanağı yerleştirin. Hücreler sonraki adımlarda önce en az 24 saat inkübe izin verin. </li></ol> 3. besi yerinden <ol><li> Hücre konfluent yüzdesini (çanak alanı kapsayan% hücreleri) belirlemek için bir mikroskop altında her bir hücre kültür çanağı gör. kuvöz ve öncesi sıcak tam orta ve 1x PBS hücreleri dönün. Hücreler% 80-100 konfluent iseniz bir sonraki adıma geçin. </li><li> Dikkatlice bozmadan harcanan orta aspireHer bir kültür kabı hücreler. </li><li> kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın. </li><li> Kısım 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin-EDTA ve yavaşça kaya eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelerine temin etmektedir. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu kuluçka sırasında, kısım kadar kültür tabaklarında tam ortam, 10 ml cm2 başına 2,500-5,000 hücre hücre yoğunluğu elde etmek için gereklidir. </li><li> Hücreler plakasından ayrılmış olduğunda, hızlı bir şekilde 1 x tanımlanan tripsin inhibitörü 3 ml ilave edilir ve yavaşça tripsin-EDTA tüm nötralize edilmiş olmasını sağlamak için 1 dakika için çanak girdap. </li><li> steril bir 15 ml&#39;lik santrifüj tüpüne ayrılmış hücreleri aktarın ve kenara. Kalan hücreler bir araya ve aynı 15 mi santrifüj borusuna bu transfer çanak PBS 1X 3 ml ekleyin. </li><li> 150 xg santrifüj edilerek pelet hücreleri5 dakika karıştırıldı. </li><li> Süpernatant aspire ve tam ortam 3 ml hücre pelletini. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı ve cm2 başına 2,500-5,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek için tam ortam 15 ml ihtiva eden 150 mm kültür kaplarına tohum. Her bir kap-bağlanma tahlili için iki 150 mm kullanın. Not: sıvı ortam ile hücrelere oksijen difüzyon Cilt 36 bağlıdır. Süspansiyon içindeki yapışan hücreler veya hücre kullanılıp kullanılmadığını deneyler arasında tutarlı medya hacmini tutulması tavsiye edilir. Medya yayılmasında bu değişkenliğe önlemek için (Tartışma tartışıldığı gibi 24 saat iş istasyonu inkübe) önceden klimalı edilebilir. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübatör tohumlanmış kültür yemekler yerleştirin. Hücreler sonraki adımlara geçmeden önce en az 24 saat inkübe izin verin. </li></ol> 4. Physioxic Pozlama <ol><li> mikroskop altında hücre gör. bes içint sonuçları, hücreler 24 saat pozlama için% 70-80 konfluent, 48 saat pozlama için% 50-60 konfluent ve 72 saat pozlama için% 40-50 konfluent olduğundan emin olun. </li><li> İstenen süre (24, 48, ya da deneye bağlı olarak 72 saat) hipoksiyaya iş istasyonuna hücreleri yerleştirin. </li><li> Uygun physioxia için iş istasyonu ayarlayın. NOT: Örneğin,% 3 O 2 ayar% 5 CO 2 ve% 92 N2 eşlik ediyorum. NOT: Dinamik aralık içinde oksijen dalgalanmaları aracı haline belirli bir zaman çizelgesi, program takvimi üzerinde istenen veya manuel olarak istenen aralıklarla oksijen ayarlarını varsa. </li><li> % 60 nem ayarlayın. iş istasyonu atmosfer yine de çok kuru ve medya belirgin uzun deneyler (&gt; 48 saat) boyunca buharlaşır. (Ortam iş istasyonu bir atmosfer ile dengelenir böylece) hücre kültürü DIS ortamı doldurmak için iş istasyonu olan bir hücre kültür şişesi içinde ortam rezervini muhafazahes. Not: çözünmüş oksijen, atmosferik oksijen 36 dengelenir, böylece (örneğin, PBS ve tripsin-EDTA gibi) liziz önce hücreler ile etkileşim herhangi bir çözüm hipoksi iş istasyonu olan, kullanımdan önce, 24 saat için önceden şartlandınlmalıdır. </li><li> lizis kadar iş istasyonu içinde hücreler tutun. </li></ol> Cap-bağlama deneyi 5. hazırlanması Tamponlar <ol><li> 1x Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) hazırlayın. <ol><li> DH 2 O 800 ml, 8.76 g, NaCl ve 6.05 g Tris baz çözülür. </li><li> 1 M HCI kullanılarak 7.4&#39;luk bir nihai pH&#39;a çözüm sağlamaktadır. </li><li> DH 2 O. kullanarak 1 L son hacim kazandırın </li></ol></li><li> denatüre lizis tamponu hazırlayın. Cap-bağlama analizinin yapılacağı güne liziz tamponunda hazırlanır. Boş agaroz boncuk ve γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk (7,9 ve 7.13 adımlar) yıkamak için ekstra lizis tamponu yapın. <ol><li> DH 2 O 7 ml, 160 ul 5 M NAC eklemeL, 160 ul 1 M Tris-HCI pH 7.4, 40 ul 200 mM NaF, 40 ul 1 M MgCl2, 40 ul 1 mM sodyum ortovanadat. </li><li> 7 mi çözeltisine Igepal 40 ul ekle. son derece viskoz olduğu gibi Igepal ™ almak yardımcı olmak için pipet ucu kesin. </li><li> Igepal tüm çözünmüş kadar, aşağı yukarı pipetleme veya vorteks 7 ml solüsyon karıştırın. </li><li> 8 ml çözeltinin son hacmi kaldırın ve buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> 4x sodyum dodesil sülfat (SDS) -PAGE Örnek Tamponu hazırlayın. <ol><li> Bir cam kaba, 16 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8, 12.64 ml gliserol, ve 8 ml ditiotreitol (DTT) birleştirir. </li><li> SDS 3.2 g ve bromofenol mavisi, 0.16 g ekleyin. Toz tamamen manyetik karıştırıcı ile karıştırılarak erimesine izin verir. </li><li> -20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kısım ve mağaza. </li></ol></li></ol> 6. Hücre Liziz <ol><li> denatüre edici olmayan lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde th günlük tutmakE Cap-bağlanma tahlili. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1 x PBS öncesi sıcak ve tripsin. </li><li> Her bir kap-bağlanma tahlili için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine lizis tamponu kısım 980 ul yapılmaktadır. </li><li> liziz tamponu 980 ul 4- (2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorür 10 ul ve 100x proteaz önleyici kokteyl 10 ul ekle. buz üzerinde tutun. </li><li> hipoksi iş istasyonu içinde bir çöp konteynırına her 150 mm çanak medya atın. </li><li> Sıcak 1x PBS 3-4 ml hücreleri yıkayın ve tüm sıvı atın. </li><li> Her bir tabak sıcak% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml ilave edilir ve 2 dakika boyunca ya da hücreleri artık plakaya tutunur kadar bekletin. </li><li> Bir pipet kullanarak, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir plaka hücreleri transferi. hücrelerin her plaka ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılır, böylece gerektiğinde tekrar edin. </li><li> 90 saniye t 6,000 xg&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri santrifüjO pelet hücreleri. </li><li> pelet bozmadan pipet kullanarak tripsin aspire. pelet 90 saniye boyunca 6.000 xg, yeniden santrifüj 1,5 ml&#39;lik ependorf tüp rahatsız edilirse. </li><li> nazikçe sadece pelet yukarıda tüpe PBS 200 ul pipetleme sıcak 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Yeniden santrifüj pelet rahatsız olup olmadığını. </li><li> pelet bozmadan PBS aspire. </li><li> 1 ml Pipet 500 ul birinci hücresel pelet üzerine liziz tampon çözeltisi hazırlandı. Yukarı ve aşağı pipetleme tamamen pelletini. </li><li> İkinci hücre pelet ile yeniden süspanse hücreleri birleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleme ikinci pelletini. Tüm topaklar birleştirildi ve her bir örnek için yeniden süspanse edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde liziz tamponunda kalan 500 ul lizat birleştirin. </li><li> hipoksi iş istasyonundan örnekleri çıkarın. Not: liziz tamponu ilave edildikten sonra, birII Daha sonraki aşamalar, hipoksi, iş istasyonu, 37 ° C olarak ayarlanmış ve aşağıdaki adımlar soğuk (4 ° C veya buz üzerinde) gerçekleştirilir edilecek olduğu gibi çevre havası ifa edilecek olan vardır. </li><li> Lyse 1.5-2 saat boyunca 4 ° C&#39;de örnekleri çevirerek nazik ajitasyon kullanılarak hücreler. </li><li> selüler artığın ayrılması için 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de lize hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp lizat aktarın ve pelet atın. </li><li> Süpernatantın bir kısmı (% 5-10), gelecekte Western blot analizi için bir bütün hücre lizatı giriş kontrol olarak kullanılmak üzere ayırın. </li></ol> 7. Cap-bağlanma deneyi <ol><li> Her numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ayırmak için boş agaroz boncuk kontrol bulamacın 50 ul ve γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlanmış boncuk çamuru 50 ul transfer. boncuk bulamaç toplanmasını kolaylaştırmak için pipet ucu çıkarmak için makas kullanın. </li><li> boncuk b peletY 30 sn boyunca 500 xg&#39;de bulamaç santrifüj. </li><li> dikkatlice Süpernatantı ve TBS 500 ul boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Tekrarlayın 7.2 ve 7.3 adımları tekrarlayın. 30 saniye boyunca 500 xg&#39;de boncuk Pelet ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Boş agaroz boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp adım 6.19 lizat içeren süpernatant aktarın. NOT: Boş agaroz boncuklar non-spesifik boncuk ile etkileşime lizat proteinleri kaldırmak için bir ön temizleme adımı olarak hareket ederler. </li><li> yavaşça sallanarak 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 30 saniye boyunca 500 xg&#39;de santrifüj edilerek boş agaroz boncuk pelet. </li><li> Γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne lizat aktarın. </li><li> Liziz tamponu 500 ul boncuk yeniden süspanse 30 sn boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleme ile boncuk tane haline ve Superna ayıklayarak boş agaroz boncuk yıkayıntant. Beş yıkar toplam bu dört kez tekrarlayın. </li><li> 1x SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde boş bir agaroz boncuklar tekrar süspansiyon ve 95 ° C&#39;de 90 sn için boncuk kaynatın. gelecekteki Western blot analizi için -20 ° C&#39;de saklayın ilgili protein boncuk olmayan spesifik olarak bağlanan bakmaktır. </li><li> Cap bağlayıcı proteinler yakalamak için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar ile lizat inkübe edin. </li><li> 30 saniye için 500 x g&#39;de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet. süpernatant atın. </li><li> Adım 7.9 yineleyerek γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk yıkayın. </li><li> liziz tamponu 600 ul boncuk tekrar. </li><li> 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar GTP ekleyin. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar + 1 mM GTP inkübe edin. Not: Bunon-spesifik m 7 GTP ile etkileşim proteinleri ilişkisini (yani, non-metile GTP ile etkileşim). </li><li> 30 saniye için 500 x g&#39;de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet. </li><li> yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatantı aktarın ve 4x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) 200 ul ilave edin. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C &#39;de GTP kontrol örneği saklayın. adım 7.9 tekrarlayarak boncuk yıkayın. </li><li> 90 sn için 95 ° C &#39;de 1 x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) ve kaynama boncuk tekrar. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C &#39;de 7 m GTP&#39;ye bağlı fraksiyonu saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li><li>Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4+initiation+factors:+effectors+of+mRNA+recruitment+to+ribosomes+and+regulators+of+translation.">eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.</a> Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).</li><li>Weingarten-Gabbay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genetics.+Systematic+discovery+of+cap-independent+translation+sequences+in+human+and+viral+genomes.">Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes.</a> Science. 351 (6270), (2016).</li><li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes.">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biol. 16, 90 (2015).</li><li>Ho, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Reprogramming+of+Translation+Efficiencies+on+Oxygen+Stimulus.">Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus.</a> Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).</li><li>Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+studies+uncover+the+diversity+of+modes+of+mRNA+recruitment+to+eukaryotic+ribosomes.">Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).</li><li>Ho, J. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cap+for+Every+Occasion:+Alternative+eIF4F+Complexes.">A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes.</a> Trends Biochem Sci. , (2016).</li><li>Lin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHAS-I+as+a+link+between+mitogen-activated+protein+kinase+and+translation+initiation.">PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation.</a> Science. 266 (5185), 653-656 (1994).</li><li>Richter, J. D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cap-dependent+translation+by+eIF4E+inhibitory+proteins.">Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins.</a> Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).</li><li>Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+interaction+of+the+mammalian+eIF4E-related+protein+4EHP+with+4E-BP1.">Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1.</a> FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).</li><li>Rom, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+4EHP,+a+novel+mammalian+eIF4E-related+cap-binding+protein.">Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein.</a> J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+4EHP-GIGYF2+translational+repressor+complex+is+essential+for+mammalian+development.">A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development.</a> Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).</li><li>Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+messenger+RNA+cap-binding+protein+using+a+new+affinity+medium.">Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium.</a> Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).</li><li>Kiriakidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA+m7G+cap+binding-like+motif+within+human+Ago2+represses+translation.">An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation.</a> Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).</li><li>Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+induced+fit+recognition+of+an+m(7)GpppG+cap+analogue+by+the+human+nuclear+cap-binding+complex.">Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.</a> EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).</li><li>Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+cap-binding+complex+and+RNA+export+factor+is+required+for+intronless+mRNA+export.">The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).</li><li>Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+and+dynamic+localization+of+an+alternative+isoform+of+the+cap-binding+complex+subunit+CBP20.">Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20.</a> Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).</li><li>Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+cap-binding+protein+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).</li><li>Ptushkina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+eIF4E+protein+in+Schizosaccharomyces+pombe+has+distinct+eIF4G-binding+properties.">A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).</li><li>Cho, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+for+translational+control:+inhibition+via+5'-3'+mRNA+tethering+by+Bicoid+and+the+eIF4E+cognate+4EHP.">A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP.</a> Cell. 121 (3), 411-423 (2005).</li><li>Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+a+small+subset+of+Caenorhabditis+elegans+mRNAs+is+dependent+on+a+specific+eukaryotic+translation+initiation+factor+4E+isoform.">Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform.</a> Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).</li><li>Timpano, S., Uniacke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cells+Cultured+Under+Physiological+Oxygen+Utilize+Two+Cap-binding+Proteins+to+Recruit+Distinct+mRNAs+for+Translation.">Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation.</a> J Biol Chem. , (2016).</li><li>Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+experience+with+118+brain+tissue+oxygen+partial+pressure+catheter+probes.">Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes.</a> Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).</li><li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers.">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery.">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li><li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy.">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation.">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li><li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation:+the+impact+of+ambient+oxygen+availability.">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li><li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers.">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394 (2002).</li><li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hypoxia. , (2001).</li><li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi's+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling.">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts.">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li><li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous.">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li><li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium:+assumptions+and+pitfalls.">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1:+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E.">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li><li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+(eIF4G)+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E.">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li><li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP.">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+structure,+mechanism,+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity.">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li><li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins.">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li><li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members.">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Fizyolojik oksijen koşullarına maruz insan hücrelerinde kap bağlayıcı proteinlerin analizi, yeni oksijen regüle çeviri başlatma faktörlerinin tanımlanması için izin verir. MRNA veya başka bir kap ile ilişkili proteinlerin hem 5 &#39;başlık için bu faktörlerin afinite m 7&#39;ye olan ilişkilerine gücü ölçülebilir agaroz boncuklar GTP-bağlı. Bu tekniğin bir uyarı proteinlerin post-lisis kapağı bağlama potansiyelini ölçer, ancak, protein-protein etkileşimleri ve post-translasyo...

Çeviri kontrol özellikle hücresel stres 1 dönemlerde, gen ifadesinin transkripsiyonel düzenlemeye eşit derecede önemli bir adım olarak ortaya çıkmaktadır. Çeviri kontrolünün odak noktası protein sentezi ilk adımları 7-methylguanosine ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E) bağlanma içeren başlatılması hız kısıtlayıcı adım (m 7 GTP) mRNA 2 5 &#39;kapak olan . eIF4E eIF4A, bir RNA helikaz ve eIF4G, diğer çeviri faktörleri ve 40S 3 ribozom alımı için gerekli bir iskele protein içerir eIF4F adında bir trimerik kompleksinin bir parçasıdır. Normal fizyolojik şartlar altında, mRNA büyük çoğunluğu bir kapak-bağımlı mekanizma yoluyla çevrilir, hücresel stres dönemlerinde, insan mRNA yaklaşık% 10 1,4 intiation kap bağımsız çeviri izin verebilir 5 &#39;UTRs içerir. Cap-bağımlı çeviri tarihsel eşanlamlı olmuşturous eIF4F ile, ancak, eIF4F stres özgü varyasyonlar eğilimi konu 5-8 haline gelmiştir. Çeşitli hücresel stresler eIF4E aktivite rapamisin kompleksi 1 (mTORC1) memeli hedefin üzerinden bastırılmış neden olur. Bu kinaz hedefleri birinin aktivite artışı ile sonuçlanır stres altında güçleşir, (4E-BP) proteini 4E bağlayıcı değildir. Fosforilatlanmamış 4E-BP eIF4E ve bloklar eIF4G kap bağımlı çeviri 9,10 baskı neden ile etkileşim yeteneğini bağlanır. İlginç bir şekilde, eIF4E2 (veya 4EHP) adı eIF4E bir homologu, belki de stres kaynaklı baskı kaçmasına izin 4E-BP 11 için daha düşük bir afiniteye sahiptir. Gerçekten de, ilk bağlı eIF4G 12 ile etkileşim olmayışı nedeniyle çevrilmesinin bir bastıncısı olarak, özelliği, eIF4E2 hipoksik strese 6,13 sırasında 3 &#39;UTR RNA hipoksiya tepki unsurları içeren mRNA yüzlerce çeviri başlatır. Bu aktivasyon, IeIF4G3, RNA hipoksik eIF4F kompleksi veya eIF4F H 6,13 teşkil protein motifi 4, ve hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 2a bağlayıcı etkileşimler yoluyla elde s. Normal koşullar altında, bir bastıncısı olarak eIF4E2 GIGYF2 ve ZNF598 14 ile bağlanmaktadır. Bu kompleksler, kısmen, Agaroz bağlanmış m 7 GTP afinite reçinesi ile tespit edilmiştir. Bu klasik yöntem 15 çeviri alanında standart ve en iyi ve en yaygın aşağı çekme de kap-bağlama kompleksleri izole etmek için tekniği kullanılmıştır ve in vitro bağlanma deneyleri 16-19 olduğunu. Kap-bağımlı çeviri makine arası değişen parçalar 6-8,13 gibi esnek ve uyarlanabilir ortaya çıkmaktadır olarak, bu yöntem hızla stres yanıtı katılan yeni kap-bağlayıcı proteinlerin tanımlamak için güçlü bir araçtır. Birkaç ökaryot model sistemler stres yanıtları gibi bir eIF4E2 homolog kullanmak göründükleri gibi Dahası, eIF4F değişimleri geniş etkileri olabilirC. thaliana 20 gibi, S. Pombe 21, D 22 melanogaster ve C 23 elegans. Kanıt eIF4F değişiklikler sıkı koşullar stres, ancak normal fizyolojisi 24 dahil olmak sınırlandırılamaz düşündürmektedir. (Mikroelektronlar üzerinden ölçülen) (kılcal uçlarında) ya da dokular içinde dokulara oksijen kaynağı beyindeki 25% 2-6 arasında değişmektedir, akciğerlerde 26% 3-12, bağırsak 27,% 4 in 3,5-6% karaciğer 28, böbrek 29% 7-12, kas 30 içinde% 4 ve kemik iliği 31% 6-7. Hücreler ve mitokondri% 1,3 oksijen 32 daha az içerirler. Bu değerler hücrelerinin rutin olarak kültürlendiği olan çevre havası daha hipoksiye daha yakındırlar. Bu ne daha önce hipoksi özgü hücresel süreçleri fizyolojik bir ortamda ilgili olabileceği gibi düşündüm olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, eIF4F ve eIF4F H </sup&gt; aktif fizyolojik oksijen ya da &quot;physioxia&quot; 24 maruz çeşitli insan hücre çizgileri belirgin havuzlar ya da mRNA sınıfları için başlatma katılabilir. Düşük oksijen, aynı zamanda uygun fetal gelişim 33 sürücüler ve hücreler genellikle daha yüksek çoğalma oranları, uzun ömürleri, daha az DNA hasarını ve physioxia 34 daha az genel stres yanıtları var. Bu nedenle, eIF4F lH olasılıkla fizyolojik koşullar altında seçme genin ifadesinde önemli bir faktördür. Burada, sabit fizyolojik oksijen koşullarında veya doku mikroçevrelerde büyük olasılıkla daha fazla temsilcisi olan dinamik bir dalgalanma aralığı kültür hücreleri bir protokol sağlar. Bu yöntemin bir avantajı, hücre hipoksi iş istasyonu içinde lize olmasıdır. Hücre lizizi hipoksik hücre kültüründen geçiş diğer protokollere yapılan ne sıklıkta açık değildir. Hücreler genellikle ilk olarak küçük bir hipoksi inkübatör kaldırılır olmakoksijene hücresel yanıtı (bir ya da iki dakika) 35 hızlı olduğu ön parçalama, ancak oksijen bu poz biyokimyasal yollar etkileyebilir. Bazı kap-bağlayıcı proteinler ikinci bir baz ile etkileşimleri gerektiren veya bu nedenle bazı kapak interaktörler arıtma sürecinde gözden kaçabilir m 7 GTP, hidrolize olabilir. Agaroz bağlanmış enzimatik dayanıklı kap analoglarına Bu protokolde ikame edilebilir. Burada anlatılan yöntemi ile aktivite ve eIF4F H ve eIF4F diğer varyasyonları kompozisyonunu keşfetmek hücreler fizyolojik koşullar ya da stres yanıtları sırasında kullanmak karmaşık gen ifadesi makine ışık tutacaktır.

<table><tbody><tr><td>&amp;gamma;-aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP agarose C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-linked beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP</td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10-cm culture dish</td></tr><tr><td>150 mm culture dish</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm culture dish</td></tr><tr><td>AEBSF Hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&amp;nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agarose bead control</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>1.5 ml Centrifuge Tubes</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Used to centrifuge small volumes</td></tr><tr><td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Used in culturing primary cells</td></tr><tr><td>Defined trypsin inhibitor</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epithelial cell medium (complete kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Includes serum and growth factor supplements)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Component of SDS-PAGE loading buffer</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5&#039;-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 colorectal carcinoma</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Human cancer cell line</td></tr><tr><td>Human renal proximal tubular epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Standard media for human cell culture</td></tr><tr><td>Hyclone Penicillin-Streptomycin solution</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Antibiotic component of DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hypoxia workstation</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Detergent component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Monopotassium phosphate</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Cell Signalling</td><td>58715</td><td>Component of lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Component of buffers</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsin used to detach adherent cells</td></tr></tbody></table>

analysis of cap-binding proteins in human cells exposed to physiological oxygen conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Bir m 7 GTP Affinity Sütun içinde eIF4E ve eIF4E2 ve Oksijen Cevabı Cap-bağlama yeteneği analizi 1. Şekil 2, iki insan hücre çizgileri oksijen dalgalanmalara tepki olarak iki ana kap bağlayıcı proteinler tipik m 7 GTP afinite saflaştırma western lekelerinin temsil etmektedir: F ŞEKIL 1 ve kolorektal karsinom primer insan renal proksimal tübül...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions at JoVE.com

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K Görüntüleme.  University of Guelph. Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Video: Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Genetik

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

Encapsulated Hücre Agregalar içinde Takip Hipoksik Sinyalizasyonu

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Biyomühendislik

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biyokimya

DHODH ve SDH Aktivitelerini Ölçmek için Kararlı İzotop İzleme ve LC-MS Analizi

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Yazar Spotlight: Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Testler  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Biyoloji

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Encapsulated Hücre Agregalar içinde Takip Hipoksik Sinyalizasyonu

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi