Diese Arbeit wurde durch das Kernbudget des p53lab (BMSI, A*STAR) und des JCO VIP Grants (A*STAR) unterstützt.

HEK293 Zelllinie wurde für das Protokoll verwendet und wurde in Dulbecco modifizierte Adler Medium ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-Glutamin, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%CO2 in einer befeuchteten Umgebung kultiviert.
1. Quantitative Bewertung der komplexen Störung des eIF4F über eIF4E:eIF4G604-646 Complementation Assay
<ol><li>Zellkultur und transiente Transfektion von eIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungstest<ol>
<li>Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen mit weniger als 20 Passagen für alle Experimente. Bestimmen Sie am ersten Tag die Zellennummer mithilfe eines Standardzellenzählers, und zählen Sie die gesamten lebensfähigen Zellen mit der Trypan Blue Exclusion Methode13.</li>
		<li>Samen 6-Well-Platten mit 0,9 - 1,2 x 106 HEK 293 Zellen pro Brunnen in 2 ml Standardwachstumsmedium. HINWEIS: Um die beste Transfektionseffizienz innerhalb der oben angegebenen Zelllinien zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die vergoldeten Zellen am Tag nach der Aussaat 70-90% konfluent sind.</li>
		<li>Am Morgen des 2. Tages werden Zellen mit SubA-eIF4E und eIF4G604-646-SubB-Plasmid mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) wie unten beschrieben, mittransfekt.<ol>
<li>Verdünnen Sie 9 l Liposomenlösung in einem Rohr, das 125 l reduziertes Serummedium ohne Phenolrot enthält (siehe Materialtabelle)für jede Transfektion und inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
			<li>Bereiten Sie den Master-Mix der DNA vor, indem Sie für jedes Transfektionsrohr 3 g jedes Plasmids in 125 l reduziertem Serummedium verdünnen.</li>
			<li>Fügen Sie dem DNA-Master-Mix-Rohr 12 l Enhancer-Reagenzien hinzu, mischen Sie sie gut und fügen Sie sofort die DNA hinzu: Enhancer Master-Mix zu jeder Tube verdünnter Liposomen im Verhältnis 1:1. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für 24 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Am Morgen des 3. Tages, spülen Sie jeden Brunnen mit 1 ml PBS.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS und inkubieren Zellen in jedem Brunnen mit 0,3 ml Trypsin für 5 min bei 37 °C.</li>
		<li>Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot, das 0% FCS in jedem Brunnen enthält, hinzufügen und transfizierte Zellen in ein 15 ml-Rohr übertragen. HINWEIS: Phenolrot kann die Luziferase-Aktivität stören; Daher müssen die Zellen von diesem Schritt an in Medium ohne Phenolrot behandelt werden.</li>
		<li>Zellen für 5 min bei 290 x g abdrehen und das Medium ansaugen. Setzen Sie die Zellen in 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot mit 0% FCS aus. Zählen Sie wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
		<li>Samen transfizierte HEK 293 Zellen in 96 gut undurchsichtigen Platten mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Bohrkörper in 90 l Medium ohne Phenolrot, das 0% FCS enthält. Um 3 technische Replikationen innerhalb des gleichen Experiments für 3 verschiedene Verbindungen zu erhalten, säen 60 Brunnen der Platten mit Zellen, die die Brunnen an den Rändern ausschließen.</li>
		<li>Unmittelbar nach dem Aussaat der transfizierten Zellen 10 L mit 10 % DMSO-Verbindungslösung hinzufügen (siehe Schritt 1.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Compound-Vorbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie 1 mM Compound-Aktienlösungen vor, indem Sie die Zinsverbindung in 100% DMSO (v/v) auflösen. Um 3 Replikationen für jede zusammengesetzte Titration zu erhalten, verwenden Sie 8 l der 1 mM Compound-Stammlösung. HINWEIS: Das Volumen von 1 mM Stammmasse verwendet wird, ist mehr als das, was es benötigt wird. Dies geschieht, um Pipettierfehler zu berücksichtigen, falls vorhanden.</li>
		<li>Führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung der Stammverbindungslösung mit 4 l des 1 mM-Bestands in 4 l von 100 % DMSO für jeden Titrationspunkt durch. HINWEIS: Für eine vollständige zusammengesetzte Titration führen Sie 9 serielle Verdünnungen aus dem Ausgangsbestand in 100% DMSO durch. Wenn mehrere Verbindungen getestet werden müssen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und eine Mehrkanalpipette, um diesen Schritt und nachfolgende Verdünnungen zu erleichtern.</li>
		<li>Fügen Sie für jeden Punkt der 2-fachen seriellen Verdünnung 36 l Sterilwasser der HPLC-Klasse hinzu, um eine 40-L-L-10-fache Arbeitslösung in 10 % DMSO (v/v) zu erstellen (d. h. 100 bis 0,39 M 10 % DMSO-Stammserie, die zu einer von 10 bis 0,039 M,in 1 % DMSO führt, wenn zellenzugesetzt wird). Wie für die Behandlungskontrolle, bereiten Sie auch eine 10% DMSO nur Lagerlösung in HPLC-Grade sterilen Wasser.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen in der 96 gut opaken Platte 10 l 10 l 10 l 10 l 10-L-Arbeitslösungen hinzu, um die beabsichtigte Endkonzentration mit einer Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 100 l zu erzielen und 3 h bei 37 °C mit 5% v/v atmosphärischem CO2zu brüten.</li>
	</ol></li>
	<li>Luziferase-Komplementierung und Lebensfähigkeitstest<ol>
<li>Nach 3 h Arzneimittel herstellung das Luziferase-Substratreagenz durch Kombination von 1 Volumen Substrat mit 19 Volumen des Verdünnungsreagenzes (siehe Herstelleranleitung). HINWEIS: Der Luziferase-Test wird mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um sofort 25 L Substratreagenz hinzuzufügen.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte bei 350 Umdrehungen von Euro/ Mittel 50 min auf einem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Bewerten Sie die Lumineszenz mit einem Plattenleser. Stellen Sie dazu den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 455. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s.</li>
		<li>Um die Zelllebensfähigkeit zu beschwichtigen, fügen Sie 33 L des Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz hinzu und messen Sie dann die Lumineszenz nach 15 min bei Raumtemperatur mit dem Plattenleser erneut.</li>
		<li>Bewerten Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, indem Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 600 nm einstellen. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit wird durch Messung des intrazellulären ATP-Spiegels bei der Zelllyse gemäß den Anweisungen des Herstellers beurteilt. Multiplexing ist in diesem Fall möglich, da der Lebensfähigkeitstest eine andere Luziferase mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet.</li>
		<li>Verwenden Sie die Daten, um die IC50-Werte jeder Verbindung durch Kurve zu bestimmen, die die Daten an eine 4-Parameter-Anpassungskurvengleichung anpasst: Y = ((A-D)/(1+((x/C)))) + D Die numerischen Werte D und A müssen im Kurvenanpassungsprozess eingeschränkt werden: D = Leuchtwert auf der Y-Achse für minimale Kurvenasymptote oder minimale theoretische Reaktionsstufe, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet wird. A = Lumineszenzwert auf der Y-Achse für maximale Kurvenasymptote oder maximale theoretische Antwortvariablen, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet werden. ANMERKUNG: Der Wert für die minimale Reaktion wird aus der 1% DMSO (v/v) Kontrollbehandlung abgeleitet, und der Wert für die maximale Reaktion wird von der maximalen Reaktion eines mTOR-Inhibitors mit hoher Affinität abgeleitet, der ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit plateaued hat.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Korrelierende eIF4E:eIF4G604-646 Assay-Hemmung mit eIF4F-komplexer Störung in Zellen
<ol><li>Um zu bestätigen, dass das vom Test gemessene Signal der physikalischen Störung der eIF4E-eIF4G-Wechselwirkung durch die Verbindung, Samenzellen, wie in Schritt 1.1 beschrieben, entspricht.</li>
	<li>Ersetzen Sie am Tag danach das Medium durch 1 ml reduziertes Serummedium, das kein Phenolrot enthält, und brüten sie 4 h durch die Verbindung von Interesse. Stellen Sie eine Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 1 ml sicher. ANMERKUNG: Um eine Korrelation mit dem Ergebnis zu ermöglichen, verwenden Sie zusammengesetzte Konzentrationen am Anfang, Mittelpunkt und Endpunkt der gemessenen Komplementierungs-Assay-Titrationskurve.</li>
	<li>Lyse-Zellen und durchgeführt m7GTP ziehen nach unten, um eIF4F und eIF4E:4EBP1 Komplexe zu isolieren. Detaillierte Verfahren zur Durchführung des m7GTP Pull-Down-Experiments finden Sie an anderer Stelle14.</li>
	<li>Detektieren Sie m7GTP-gebundene eIF4G-, eIF4E- und 4EBP1-Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse und korrelieren Sie dann mit eIF4F-komplexer Störung mit Komplement-Assay-Signalhemmung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die in diesem Artikel beschriebene Methode nutzt einen luziferase-basierten Komplementierungstest zur quantitativen Überwachung der komplexen EIF4F-Montage durch direkte Messung der eIF4G-eIF4E-Interaktion in lebenden Zellen. Wir haben Einzelheiten für die Verwendung des eIF4E-eIF4G-Komplementierungssystems zur Verfügung gestellt und auch gezeigt, dass das System bei der Messung der medikamentös induzierten 4EBP1-vermittelten Dissoziation der eIF4E-eIF4G-Interaktion16extrem genau ist. Um den Durchsatz dieses Assays zu erleichtern, wurde das in diesem Artikel beschriebene Versuchsaufbau für eine 96-Well-Mikroplattenformat-Nutzung entwickelt.
Für optimale Ergebnisse sollten bei der Durchführung des Assays zwei kritische Schritte berücksichtigt werden. Erstens sollte die Transfektionseffizienz zwischen den Experimenten ähnlich bleiben. Dies kann durch die Verwendung von Zellen mit geringer Durchgangszahl und durch rigoroses Zählen von Zellen am Tag der Aussaat sichergestellt werden. Die Zellkonfluenkantinz sollte auch vor der DNA-Transfektion beurteilt werden, da es nicht empfohlen wird, Zellen mit lipidbasiertem Transfektionsreagenz zu transfekieren, wenn die Zellkonfluenz weniger als 70-90% beträgt. Zweitens ist es wichtig, den Komplementierungstest mit einem Zelllebensfähigkeitstest zu multiplexen. Einige Verbindungen können das Luziferase-Signal in erster Linie durch die Verringerung der Anzahl der lebensfähigen Zellen durch schädliche Effekte beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Lebensfähigkeit der Zelle unmittelbar nach dem EIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungstest zu messen, um außerhalb des Ziels und unspezifische Auswirkungen anzugehen.
Protein-Protein-Schnittstellen, wie die zwischen eIF4E und eIF4G, die frei von hydrophoben Spalten sind und relativ groß und planar sind, werden im Allgemeinen von herkömmlichen kleinen Molekültherapeutika (<500 MW)17als "nicht medikamentös" angesehen. So wächst das Interesse an der Entwicklung neuartiger Modalitäten, die effizient mit diesen Oberflächen (z. B. makrozyklische und peptidomimetische Verbindungen) interagieren. Viele dieser neuartigen Modalitäten sind jedoch nicht von Natur aus in der Lage, die Zellmembran zu überqueren und ihr Ziel zu erreichen. Um diese Probleme zu umgehen, forschen viele Forschungsgruppen an neuen Strategien zur chemischen Optimierung und Zellabgabe. Wir stellen uns vor, dass der eIF4E:eIF4G604-646 Live-Zell-PPI-Assay und andere ähnliche PPI-abgeleitete Assays eine zentrale Rolle bei der Förderung dieser Strategien und deren Validierung spielen werden.

Die Kontrolle der Genexpression spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Ausführung zellulärer Programme wie Wachstumsproliferation und Differenzierung. Ein regulatorischer Kontrollmechanismus kann entweder auf der Ebene der Gentranskription oder auf der Ebene der mRNA-Translation ausgeübt werden. In den letzten zehn Jahren ist es immer offensichtlicher geworden, dass die translationale Kontrolle durch Modulation des Initiationsprozesses und nicht durch die späteren Schritte der Dehnung und Beendigung die Synthese bestimmter Teilmengen von Proteinen, die eine breite Palette biologischer Funktionen spielen, fein regulieren kann.
Erhöhte Übersetzung von mRNAs, die am Überleben beteiligt sind, antiautophagische und anti-apoptotische Reaktionen wurden in mehrere Krebsarten verwickelt und wurden auch ursächlich mit der abnormen Aktivierung oder dem Ausdruck von Translationsinitiationsfaktoren in Verbindung gebracht1.
Der eIF4F-Komplex ist ein Master-Regulator der Übersetzungsinitiierung. Durch die Bindung der Cap-Struktur am 5' Ende von mRNAs treibt eIF4F die anfängliche mRNA-ribossome Rekrutierung voran und erhöht damit die mRNA-Translationseffizienz von schwach übersetzten eukaryotischen mRNAs2. EIF4F vermittelte Übersetzung von krebsbedingten mRNAs wurde für viele Krebsmodelle berichtet, die eine abnorme Aktivierung von RAS/MAPK- oder AKT/TOR-Signalwegen beherbergen, was darauf hindeutet, dass Krebszellen eIF4F hochregulieren, um ihre eigene proneoplastische Aktivität zu steigern. Die Störung dieser Einspeiseschleife durch Hemmung der eIF4F-Komplexbildung ist damit eine sehr vielversprechende therapeutische Strategie3,4.
Der eIF4F-Komplex besteht aus (i) eIF4E, der kappenbindenden Untereinheit von eIF4F, die mit der Cap-Struktur der 5' UTR von mRNA interagiert, (ii) eIF4A, dem RNA-Helicase und (iii) eIF4G, dem Gerüstprotein, das sowohl mit eIF4A als auch mit eIF4E interagiert und schließlich die 40S-Riboso-Subunit5rekrutiert. EIF4G-Assoziation mit eIF4E ist der preisbegrenzende Schritt für die Montage funktioneller eIF4F-Komplexe und wird durch die eIF4E-bindenden Proteine (4EBPs, Mitglieder 1, 2 und 3)negativ reguliert. Durch den Wettbewerb mit eIF4G-Bindung an eIF4E über eine Schnittstelle, die aus kanonischen und nicht-kanonischen eIF4E-Bindungssequenzen7,8,9 (Region aa 604-646 auf Human eIF4E) besteht, reduziert 4EBP den Pool von eIF4E, der aktiv an der Übersetzung und Der Verhinderung von eIF4F-Komplexbildung beteiligt ist. Das Zusammenspiel dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen wird hauptsächlich durch das Säugetierziel der rapamycin (mTOR)-vermittelten Phosphorylierung von 4EBP reguliert. Bei mitogenen Reizen phosphorisiert mTOR die Mitglieder der 4E-BP-Proteinfamilie direkt, verringert ihre Verbindung mit eIF4E und fördert damit die EIF4E-eIF4G-Interaktion und die Bildung funktioneller eIF4F-Komplexe10.
Trotz der großen Anstrengungen bei der Entwicklung von Verbindungen, die auf die komplexe Integrität von eIF4F abzielen, hat das Fehlen von Assays zur Messung der direkten Störung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen die Suche nach zellulären aktiven Schlagverbindungen eingeschränkt. Wir haben einen Luziferase-Assay auf Basis eines Coelenterazin-Analogas (z. B. Nanoluc-basierter Komplementierungs-Assay) angewendet, um den Status der eIF4F-Integrität durch die eIF4E-eIF4G-Interaktion in Echtzeit zu überwachen. Das Luziferase-Komplementierungsproteinsystem besteht aus einem 18 kDa-Proteinfragment (SubA) und 11 Aminosäure-Peptidfragment (SubB), das für minimale Selbstassoziation und Stabilität optimiert ist11. Einmal als Fusionsprodukt mit dem menschlichen EIF4E und der eIF4E-Interaktionsdomäne aus dem menschlichen eiF4G1 (aa 604-646) ausgedrückt, werden die beiden interagierenden Proteine das SubA- und SubB-Fragment in die Nähe voneinander bringen und die Bildung der aktiven Luziferase induzieren, die in Gegenwart eines zelldurchlässigen Substrats schließlich ein helles Leuchtsignal erzeugen wird (Abbildung 1). Wir haben an anderer Stelle über den Bau und die Validierung des EIF4E:eIF4G604-646 Ergänzungssystems16berichtet.
Hier beschreiben wir, wie das komplementäre System eIF4E:eIF4G604-646 (auf Anfrage erhältlich) angewendet werden kann, um 4EBP1-vermittelte eIF4E-eIF4G-Störungen in lebenden Zellen genau zu messen. Darüber hinaus zeigen wir seinen Nutzen, indem wir die Wirkung mehrerer mTOR-Inhibitoren messen, die sich derzeit in klinischen Studien als potenzielle Krebstherapeutika befinden12. Da Off-Target-Effekte oft die medikamentöse Aktivität verschleiern, beschreiben wir auch, wie die Vielseitigkeit der EIF4E:eIF4G604-646 Systemmessung mit orthogonalen Messungen der zellulären Lebensfähigkeit erweitert werden kann, um diese zu berücksichtigen.

<table><tbody><tr><td>293FT cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Cell titer Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>not applcable</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;L3000015&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Eppendorf</td><td>not appicable</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminophenyl-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;GTP (C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Die Bildung des eIF4F-Komplexes hat sich als der wichtigste nachgeschaltete Knoten für die Konvergenz von Signalsignalen erwiesen, die häufig beim Menschen onkoogene Aktivierung erfahren. eIF4F ist ein Cap-Bindungskomplex, der an der mRNA-ribossomeRekrutierungsphase der TranslationInitiation beteiligt ist. In vielen zellulären und präklinischen Krebsarten führt die Deregulierung von eIF4F zu einer verstärkten Übersetzung spezifischer mRNA-Teilmengen, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. eIF4F ist ein heterotrimerkomplex, der aus der Kappenbindungs-Untereinheit eIF4E, dem Helicase eIF4A und der Gerüstuntereinheit eIF4G gebaut wurde. Entscheidend für die Montage aktiver eIF4F-Komplexe ist die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen eIF4E- und eIF4G-Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der eIF4F-Assembly, das den Status der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen überwacht. Der eIF4e:4G zellbasierte Protein-Protein-Interaktionstest ermöglicht auch eine genaue und zuverlässige Bewertung medikamentös induzierter Veränderungen in der komplexen Integrität von eIF4F. Wir stellen uns vor, dass diese Methode zur Überprüfung der Aktivität kommerziell erhältlicher Verbindungen oder zum weiteren Screening neuartiger Verbindungen oder Modalitäten angewendet werden kann, die die Bildung des eIF4F-Komplexes effizient stören.

Um die Empfindlichkeit des Komplementierungssystems eIF4E:eIF4G604-646 zu validieren, wurde die 4EBP1-vermittelte Hemmung der eIF4F-Komplexbaugruppe mit mTOR-Inhibitoren bewertet. Durch hemmende mTORC1-Kinase-abhängige Phosphorylierung der 4EBP-Proteinfamilie verbessert die mTOR-Hemmung die 4EBP1-Assoziation mit eIF4E und damit eIF4F-Demontage15. Es wurden zwei Klassen mechanistisch unterschiedlicher MTOR-Kinasen getestet: Rapalogs (z.B. Rapamycin), die allosterische Inhibitoren von mTORC1 sind, aber keine mTORC2- und ATP-Wettbewerbshemmer (z. B. PP242), die sowohl mTORC1 als auch mTORC2 kinase-katalytische Aktivität gezielt hemmen.
HEK293-Zellen wurden mit dem komplementationssystem eIF4E:eIF4G604-646, wie in Schritt 1 beschrieben, transfiziert. Nach 24 h Transfektion wurden die Zellen wieder gesät und mit den mTOR-Inhibitoren PP242 und Rapamycin (wie in Schritt 1.2 beschrieben) behandelt. Vier Stunden nach der Behandlung wurde die Lumineszenz, wie zuvor beschrieben, bewertet, gefolgt von der Zelllebensfähigkeit. Wie in Abbildung 2dargestellt, erzeugt PP242 eine dosisabhängige Hemmung des Signals mit einem berechneten IC50 von 0,72 ± 0,04 m, während ein IC50 von 6,88 ± 0,88 m für Ramamycin abgeleitet wird ( Abbildung2A). Die Platten wurden dann für den Zelllebensfähigkeitstest multiplexiert (Abbildung 2D). Diese Analyse zeigt, dass weder PP242 noch Rapamycin eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit bewirken, was beweist, dass die Abnahme der Lumineszenz im Komplementierungssystem eIF4E:eIF4G604-646 nicht auf den unspezifischen Zelltod, sondern auf eine Störung der EIF4E:4G-Wechselwirkung zurückzuführen ist.
Ein m7GTP-Pulldown-Experiment, das durch Inkubation untransfizierter Zellen mit zusammengesetzten Konzentrationen durchgeführt wurde, die den Anfangs-, Mittel- und Endpunkten der gemessenen Titrationskurve in Abbildung 2A entsprechen, zeigt, dass 4EBP1-vermittelte Störungen der endogenen eIF4E-eIF4G-Wechselwirkung mit dem gemessenen EIF4E:eIF4G604-646 Assaysignal korrelieren (Abbildung 2B, 2C). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigt sich PP242 als ein stärkerer Inhibitor der gesamten 4EBP1-Phosphorylierung als Rapamycin unter den experimentellen Bedingungen, die in HEK 293-Zellen getestet wurden (Abbildung 3A), während beide Inhibitoren einen Einfluss auf die mTOR-Signalisierung zeigten, wobei Ramamycin gegen mTORC1-Substrate und PP242, die sowohl auf mTORC1 als auch für mTORC2 abzielten, aktiver war (Abbildung 3B).
Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass PP242 die komplexe Bildung von eIF4F effektiver stört als Rapamycin in HEK293-Zellen und zeigen ferner, dass das EIF4E:eIF4G604-646-System die komplexe EIF4F-Komplexzusammensetzung in lebenden Zellen genau messen kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig1.jpg"> Abbildung 1: eIF4E:eIF4G604-646 Komplementierungssystem. Schematische Darstellung zeigt, wie die Wechselwirkung von Protein X (eIF4E) und Protein Y (eIF4G604-646) subA- und SubB-Fusionen in die Nähe zueinander kommen und die aktive Luziferase rekonstituieren kann. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig2.jpg"> Abbildung 2: 4EBP1-vermittelte Störung des eIF4F-Komplexes. (A) PP242 und Rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 Assay Titration modellierung der Wechselwirkung zwischen eIF4E und eIF4G in transfizierten HEK 293 Zellen. (B,C) Western Blot-Analyse, die den endogene Gehalt an eIF4E, eIF4G und 4EBP1 in HEK 293-Extrakten und in m7GTP zeigt, ziehen nach inkubierender Zellen mit unterschiedlicher Konzentration von PP242 bzw. Rapamycin nach unten. (D) Behandelte Zellen in A, bei denen Multiplexe für Zelllebensfähigkeit und Lumineszenz bewertet wurden. Alle Werte stehen für mittelwert ± SD (n=3). Diese Zahl wurde von16geändert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60850/60850fig3.jpg"> Abbildung 3: Differentialwirkung der mTOR-Hemmung auf 4EBP1-Phoshorylierung. (A) Western Blot Analyse des Phosphorylierungsstatus von 4EBP1 in nicht transfizierten HEK293-Zellen, die mit einer angegebenen Konzentration von PP242 und Rapamycin behandelt wurden. (B) Western Blot Analyse des AKT- und S6-Phosphorylierungsstatus in nicht transfizierten HEK293-Zellen, die entweder mit den dualen MTORC1/2-Aktiv-Standortinhibitoren PP242 oder dem allosterischen Inhibitor von mTORC1 Rapamycin behandelt wurden. Beta-Actin wurde für die Ladekontrolle sowie insgesamt 4EBP1, AKT und S6 visualisiert. Diese Zahl wurde von16geändert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/60850/60850fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

3.0K Aufrufe.  A*STAR (Agency for Science, Technology and Research). Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Serie: Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Forschung

Genetik

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Biochemie

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologie

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Immunologie und Infektion

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Zusammenfassung

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Analyse von Cap-bindende Proteine in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

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Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

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FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

Analyse von Cap-bindende Proteine in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt