Bu protokol, çeşitli küçük moleküller için biyosensör olarak protein dimerizasyon sistemlerinin mühendisliğine genel bir yaklaşım sağladığı için önemlidir. Buna ek olarak, özel ekipman gerek kalmadan verimli ve uygun maliyetli bir şekilde farklı ligands için biyosensörler seçmek için bir son derece çeşitli protein kütüphanesi kullanır. Tasarlanmış biyosensör, hücre davranışını kimyasal olarak kontrol etmek ve hücre metabolitlerinde gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.
Bu görsel gösteri sayesinde, araştırmacılar deneysel çıktı net bir beklenti ile tekniklerin ayrıntılı bir talimat gözlemleyebilirsiniz. 37 santigrat derece ve dakikada 250 devir de yaklaşık 0,5 600 nanometre emici lik 2YT orta altı mililitre tek bir TG1 elektroporasyon yetkili hücre kolonisi büyüyerek seçim her tura başlayın. En uygun optik yoğunluğa ulaşıldığında, hücreleri buza yerleştirin.
Negatif seçim boncukları hazırlamak için, 300 mikrolitre streptavidin kaplı manyetik boncukları üç kez mililitre %05 PBS artı Ara bellek ve bir manyetik ayırma rafında yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de boncukları bir mililitre %1 kazein ile yeniden askıya alın ve boncukların bildirilen bağlama kapasitesinin beş katı biotin ile doygunlayın. Rotasyon ile oda sıcaklığında bir saat sonra, gösterildiği gibi PBS artı Tween ile boncuk beş kez ve PBS ile üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, 1%kazein de 13 faj parçacıkları için yaklaşık bir kez 10 ve PBS% 1 sığır serum albumin oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için boncuk rotasyon ile ekleyin. Kuluçka sonunda, 1.5 mililitrelik bir tüp içine supernatant aktarın. Biyotinylated ligand bağlı streptavidin boncuklar ile pozitif seçim için, biyotinylated ligand seçim negatif seçim için kullanılan boncuk hacminin yarısını doygunluk beş kez manuel göre hesaplanan tam bağlama kapasitesi.
Rotasyon ile oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka sonra, pbs artı Tween ile boncuk beş kez yıkayın ve sadece PBS ile sadece gösterildiği gibi, ve bir mililitre ile boncuk blok 1% kazein ve% 1 sığır serum albumin rotasyon ile bir saat boyunca. Kuluçka sonunda, streptavidin kaplı manyetik boncukları PBS artı Tween'de üç kez ve gösterildiği gibi pbs'de bir kez yıkayın ve streptavidin kaplı manyetik boncukları yeniden askıya almak için sınırsız faj kullanın. Boncukları rahatsız etmeden bağlanmamış faj içeren süpernatant'ı ayıklayın ve giriş olarak kullanılmak üzere numuneyi bir kenara koyun.
Daha sonra boncukları PBS artı Tween ile 10 kez ve gösterildiği gibi PBS ile beş kez yıkayın, her üç yıkamadan sonra boncukları tüp duvarlarına bağlı fajların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için yeni bir tüpe aktarın. Bağlı fajları rekabetçi bir şekilde yok etmek için, pozitif seçim boncuklarına biyotinylated olmayan ligand mikromolar konsantrasyonunun 450 mikrolitresini ekleyin ve boncukları 30 dakika boyunca rotasyona koyun. Kuluçka sonunda, çıkış olarak kullanılmak üzere yeni bir tüp içine supernatant aktarın.
Giriş titrasyonu için, PBS'de 10 seri seyreltme yi 10 kereye kadar 10 kereye kadar giriş fajı ile dokuz katına kadar hazırlayın. 10 mikrolitre giriş fajını 10 kereden 7'ye 10'a, dokuz seyreltmeden hazırlanan TG1 hücrelerinin 70 mikrolitrelik aliquotlarına aktarın. 37 santigrat derecede 45 dakika sonra, enfekte TG1 hücrelerini mililitrede 100 mikrogram ampisilin ve 37 santigrat derecede bir gecede kuluçka için %2 glikoz içeren tek tek 90 milimetrelik 2YT agar tabaklara koyun.
Ertesi sabah, faj girişini hesaplamak için formülü kullanın. Çıkış enfeksiyonu ve titrasyon için, 37 derecelik santigrat su banyosunda 45 dakikalık bir kuluçka için üç mililitre TG1 hücresine eluted fajları ekleyin. Daha sonra taze 2YT ortamda enfekte hücrelerin 10 seri seyreltme hazırlamak bir kez 10 üçüncü konsantrasyon için, ve plaka 90 milimetrelik 2YT agar yemekleri üzerinde her seyreltme 37 santigrat derece onların gecede kuluçka için.
Ertesi sabah, formüle göre faj çıktısını hesaplayın. Tek tek klonları zenginleştirilmiş bir alt kütüphaneden izole etmek için, tek kolonileri bir gecede kültürlü, faj ile enfekte TG1 hücre plakalarından, steril derin kuyu plakalarında 37 santigrat derecelik bir gecede kültürleri için iyi başına ampisilin ile takviye edilmiş 2YT ortamına 250 mikrolitreye aktarın. Hücreler yaklaşık 0,5 600 nanometre lik bir yoğunluğa ulaştığında, cm13 yardımcı fajının mililitrebaşına beş katı 10 ekleyin ve hücreleri dakikada 250 dönüşte 37 derecede 45 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, her kuyuya ampisilin ve mililitre başına 50 mikrogram kanamisin ile takviye edilmiş 2YT ortamının 500 mikrolitresini ekleyin ve plakayı bir gecede dakikada 25 derece ve dakikada 250 dönüşe yerleştirin. Ertesi sabah, faj parçacıklarının toplanması için santrifüj ile hücreleri tortu. ELISA tarafından çapa bağlama doğrulamak için, kat 96-iyi ELISA plakaları ile mililitre streptavidin başına beş mikrolitre 100 mikrolitre kaplama tampon dört derece santigrat bir gecede.
Ertesi sabah, hedef kuyulara 100 mikromografi biyotinylated hedef ve 100 mikrolitre tek mikromolar biotin veya uygun kontrol kuyularına hedef homolog eklemeden önce pbs artı Tween 300 mikrolitre plakaları üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat sonra, plakaları yıkama başına PBS artı Ara ile beş kez yıkayın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca her kuyu başına %1 kaze 300 mikrolitre ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin. Kuluçka sonunda, taze PBS artı Tween yıkama başına üç kez plakaları yıkayın ve saflaştırılmış faj supernatant ekleyin.
Oda sıcaklığında bir saat sonra, tabakları her yıkamada taze PBS ve Tween ile 10 kez yıkayın. Oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya 100 mikrolitre horseradish peroksidaz M13 majör kat protein antikorekleyin. Daha sonra tabakları gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında veya gözle görülür bir renk değişimi gözlemlenene kadar 10 dakikalık bir kuluçka için her kuyuya 100 mikrolitre TMB substrat ekleyin.
Sonra kuyu başına tek molar hidroklorik asit 100 mikrolitre ile reaksiyonu durdurmak ve bir spektrofotometre üzerinde 450 nanometre plaka okuyun. Çapa bağlayıcı doğrulaması yapıldıktan sonra, demirbağlayıcı-ligand kompleksini hedefleyen aynı protein kitaplığı kullanılarak dimerizasyon bağlayıcı taraması da yapılmalıdır. Dört ila altı tur seçimden sonraki tipik zenginleştirme sonuçları, alt kütüphanelerde potansiyel isabet oranının yüksek olduğunun iyi bir göstergesidir ve bu durumda daha fazla seçim turuna gerek olmayabilir.
Tek klonlu ELISA, çapa ve dimerizasyon bağlayıcılarının göreceli bağlama afiyetini ve seçiciliğini analiz etmek için uygundur ve klonlar arasında bağlayıcı seçiciliğin karşılaştırılmasını kolaylaştırır. Aynı şekilde, dimerization bağlayıcı seçimi sadece ligand veya olmadan immobilize çapa bağlayıcı ile bir heterodimer oluşturan klonların belirlenmesini sağlar. Bu ligand konsantrasyonuna bağlı bağlayıcı veriler, test edilen nanocisimlerin, kontrol numunelerinin gösterdiği zayıf bağlamaya kıyasla kimyasal olarak indüklenen bir dimerizasyon sistemi oluşturmak için uygun olduğunu göstermektedir.
Ayrıca, analitik boyut dışlama kromatografisi ligand varlığında çapa ve dimerizasyon bağlayıcılar arasındaki heterodimer oluşumunu doğrulamak için kullanılabilir. Örneğin, bu deneyde, çapa ve dimerizasyon bağlayıcıları ve kannabidiol karıştırıldığında bir dimerization tepe gözlendi. Buna karşılık, cannabidiol yokluğunda veya her bağlayıcı tek başına sütuna yüklendiğinde hiçbir dimerization tepe algılandı.
Protein dimerizasyon sistemi, in vivo uygulamaları geliştirmek için seçilen biyosensörlerin daha fazla doğrulanmasına olanak sağlamak için genetik olarak maya veya memeli hücrelerinde kodlanmalıdır. Bu yöntemin diğer araştırmacılara önemli metabolitleri, sinyal molekülleri veya yüksek spatiotemporal çözünürlükte in vivo ilaçları tespit etmek için etkili ve gerekli araçları sunmasını bekliyoruz.
