Этот протокол имеет важное значение, поскольку он обеспечивает общий подход к инженерным системам димеризации белка в качестве биосенсоров для различных малых молекул. Кроме того, он использует одну разнообразную белковую библиотеку для выбора биосенсоров для различных лигандов эффективным и экономичным способом без необходимости в специализированном оборудовании. Разработанный биосенсор может быть использован для химического контроля поведения клеток и мониторинга изменений в метаболитах клеток в режиме реального времени.
Благодаря этой визуальной демонстрации, исследователи могут наблюдать подробную инструкцию методов с четким ожиданием экспериментального выхода. Начните каждый раунд отбора, выращивая один TG1 электропорации компетентных клеточной колонии в шесть миллилитров 2YT среды при 37 градусов по Цельсию и 250 оборотов в минуту до 600-нанометров поглощения примерно 0,5. Когда оптимальная оптическая плотность будет достигнута, поместите клетки на лед.
Чтобы подготовить отрицательный выбор бисера, мыть 300 микролитров стрептавидина покрытием магнитных бусин три раза с одним миллилитром 05%PBS плюс Tween буфера и два раза с одним миллилитром PBS за стирку на магнитной стойке разделения. Resuspend шарики с одним миллилитром 1%casein в PBS, и насыщают шарики с biotin на 5 времен сообщенной емкости связывания шариков. После одного часа при комнатной температуре с вращением, мыть бисер пять раз с PBS плюс Tween и три раза с PBS, как попродемонстрировано.
После последней стирки добавьте примерно один раз 10 к 13 фаговым частицам в 1%casein и 1%бычьему альбумину сыворотки в PBS к бисеру для часовой инкубации при комнатной температуре с вращением. В конце инкубации перенесите супернатант в 1,5-миллилитровую трубку. Для положительного отбора с биотинилированными лиганд-связанными стрептавидидиными бусинами насыщают половину объема бисера, используемого для отрицательного отбора в биотинилированном лиганде выбора, в пять раз больше полной связывающей мощности, рассчитанной в соответствии с руководством.
После одного часа инкубации при комнатной температуре с вращением, мыть бисер пять раз с PBS плюс Tween и три раза с PBS только, как попродемонстрировано, и блокировать бисер с одним миллилитр 1%casein и 1%bovine сыворотки альбумин в течение одного часа с вращением. В конце инкубации, мыть стрептавидин покрытием магнитных бусин три раза в PBS плюс Tween и один раз в PBS только, как попродемонстрировано, и использовать неограниченный фаг, чтобы повторно использовать стрептавидин покрытием магнитных бусин. Извлекайте несъединый фаг-содержащий супернатант, не нарушая бисер, и отложите образец в сторону для использования в качестве ввода.
Затем мыть бисер 10 раз с PBS плюс Tween и пять раз с PBS, как попродемонстрировано, передача бисера в новую трубку после каждых трех моет, чтобы избежать неспецифического связывания связанных фагов к стенкам трубки. Чтобы конкурентоспособно утоить связанные фаги, добавьте 450 микролитров микромолярной концентрации не биотинилированного лиганда к положительному отбору бисера, и поместите шарики на вращение на 30 минут. В конце инкубации перенесите супернатант в новую трубку, которая будет использоваться в качестве выходной.
Для ввода титрование, подготовить 10 серийных разбавлений в PBS до одного раза от 10 до девяти раз с входным фагом. Передача 10 микролитров входного фага из 10 раз в семь-десять до девяти разбавлений в 70-микролитерные алициты подготовленных клеток TG1. После 45 минут при 37 градусах Цельсия, пластины инфицированных клеток TG1 на отдельные 90-миллиметровые 2YT агар блюда, содержащие 100 микрограммов на миллилитр ампициллина и 2%глюкозы для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию.
На следующее утро используйте формулу для расчета ввода фагов. Для выходной инфекции и титрования добавьте элевированные фаги к трем миллилитрам клеток TG1 для 45-минутной инкубации в 37-градусной водяной бане по Цельсию. Затем приготовьте 10 серийных разбавлений инфицированных клеток в свежем 2YT среде до одного раза от 10 до третьей концентрации, и пластины каждого разбавления на 90-миллиметровых 2YT агар блюда для их ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию.
На следующее утро вычислите выход фагов по формуле. Чтобы изолировать отдельных клонов от обогащенной сублибрарии, перенесите одиночные колонии из ночных, зараженных фагом клеточных пластин TG1 в 250 микролитров среды 2YT, дополненных ампициллином на колодец в стерильных глубоководных пластинах для их ночной культуры при 37 градусах цельсия. Когда клетки достигают 600-нанометровой плотности примерно 0,5, добавьте пять раз 10 к девяти единицам, образующим бляшки на миллилитр СМ13, и инкубировать клетки в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия при 250 вращениях в минуту.
В конце инкубации добавьте 500 микролитров среды 2YT, дополненных ампициллином, и 50 микрограммов на миллилитр канамицина к каждой хорошо, и поместите пластину на 25 градусов по Цельсию и 250 вращений в минуту на ночь. На следующее утро осадок клеток центрифугации, чтобы позволить сбор фаговых частиц. Для проверки якорного связывания ELISA, пальто 96-ну ELISA пластин с 100 микролитров пять микрограмм на миллилитр стрептавидина в буфер покрытия при четырех градусах по Цельсию в одночасье.
На следующее утро, мыть пластины три раза в 300 микролитров PBS плюс Tween перед добавлением 100 микролитров одноцелерной биотинилированной цели в целевых скважин и 100 микролитров одного микромолара биотина или целевой омолог в соответствующие скважины управления. После одного часа при комнатной температуре, мыть пластины пять раз с PBS плюс Tween за стирку, и блокировать любые неспецифические связывания с 300 микролитров 1%casein на колодец в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть пластины три раза в свежем PBS плюс Tween за стирку, и добавить очищенный фаг супернатант.
После одного часа при комнатной температуре, мыть тарелки 10 раз со свежим PBS плюс Tween за стирку. Добавить 100 микролитров хрена peroxidase M13 основных антител белка пальто к каждому хорошо в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. Затем мыть пластины в три раза, как попродемонстрировано, и добавить 100 микролитров субстрата TMB к каждому хорошо в течение 10-минутной инкубации при комнатной температуре или до тех пор, пока видимые изменения цвета наблюдается.
Затем остановите реакцию с помощью 100 микролитров одномолярной соляной кислоты на колодец и прочитайте пластину на 450 нанометров на спектрофотометре. После проверки якорного связующего, димеризация связующего скрининга также должна быть выполнена с использованием той же библиотеки белка ориентации якорь связующего-лиганд комплекса. Типичные результаты обогащения после четырех-шести раундов отбора являются хорошим свидетельством того, что существует высокое соотношение потенциальных попаданий в подлибрях, и в этом случае дальнейшие раунды отбора могут не потребоваться.
Одно клон ELISA подходит для анализа относительной связывающей близости и селективности связующих якорных и димеризации и облегчает сравнение связывающей избирательности между клонами. Аналогичным образом, выделение связующего димеризации позволяет идентифицировать клонов, которые образуют гетенодимер с обездвиженным связующим звеном якоря только с лигандом или без него. Эти данные, зависящие от концентрации лигандов, свидетельствуют о том, что проверенные нанобои подходят для построения химически индуцированной системы димеризации по сравнению с плохой привязкой, продемонстрированой контрольными образцами.
Кроме того, аналитическая хроматография с исключением размеров может быть использована для подтверждения образования гетенодимера между якорными и димеризации связующих в присутствии лиганда. Например, в этом эксперименте пик димеризации наблюдался, когда якорные и димеризации связующих и каннабидиол были смешаны. В отличие от этого, пик димеризации не был обнаружен при отсутствии каннабидиола или когда каждый связующего был загружен в столбец в одиночку.
Система димеризации белка должна быть генетически закодирована в дрожжах или клетках млекопитающих, чтобы обеспечить дальнейшую проверку выбранных биосенсоров для разработки виво-приложений. Мы ожидаем, что этот метод даст другим исследователям эффективные и необходимые инструменты для обнаружения важных метаболитов, сигнальных молекул или препаратов in vivo с высоким spatiotemporal разрешением.
