Bu yöntem, nöral ata hücrelerinin dinamiği ve omurgalı beyin gelişiminin altında yatan bunların soyundan gelen temel soruların yanıtlatılabiliyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, gelişimin birçok saat boyunca canlı beyin içinde klonsal ilişkili hücrelerin birden fazla kümeleri doğrudan görselleştirmek için yeteneğidir. Protokol ayrıca zebrabalığı embriyonun diğer gelişmekte olan sistemlerinde klonal ve ata dinamiğinin incelenmesiiçin de uygulanabilir.
Bu yöntemi kullanarak görselleştirme özellikle nöral gelişim sırasında meydana gelen temel süreçleri doğrudan gözlemlemek için yararlıdır. Öğleden sonra mikro enjeksiyonlar gerçekleştirmeden önce, cinsiyet ayrı çiftleşmiş tanklarda yabani tip yetişkin zebra balığı kurmak. Ertesi sabah dna çözeltisini el yazması yönlere göre hazırlayın ve döllenmeden sonraki 45 dakika içinde bu çözeltinin yaklaşık 4,2 nano litresini bir hücre zebra balığı embriyosuna enjekte edin.
E üç orta ve 28 santigrat derece inkübatör 24 saat boyunca enjekte embriyolar korumak, sonra gruptan ölü ve deforme embriyolar arayın. 50 mililitrelik bir tüp içine 20 kadar sağlıklı embriyo transfer, E üç 10 mililitre ile doldurun ve her tüpün üstüne bir kap yerleştirin. 50 mililitrelik tüpleri dik bir şekilde 80 ila 90 dakika boyunca 37 derece lik su banyosuna yerleştirin, banyodaki su seviyesinin tüpteki E üçünden daha yüksek olduğundan emin olun.
Tüp rafını su banyosundan çıkarın ve 28 santigrat derece kuluçka makinesine yerleştirin. E üçün soğuması ve embriyoların ısıya alışması için bir saate kadar bekleyin. Daha sonra 0.2 milimolar PTU ve E üç 28 santigrat derece inkübatör sıcak tutulan Petri yemekleri aktarın.
Isı şokundan 2-4 saat sonra, başarılı Brainbow rekombinasyonunu gösteren CFP veya YFP ekspresyonu için embriyoları standart floresan diseksiyonu mikroskobu altında inceleyin. Boyunca sağlam bir FP ifadesi ile embriyoları seçin ve Bunları PTU ile ayrı bir tabağa aktarın. Onları bir, iki veya üç gün sonra döllenme görüntü.
Floresan mikroskobualtında loş görünen ifade aslında konfokal zaman atlamalı görüntülemede iyi görüntülenebilir. Deney gününden önce, görüntüleme odasını ve embriyo manipülasyon aracını hazırlayın. Görüntüleme odası hazırlamak için, dikkatle 60 milimetre Petri çanak merkezine plastik bir halka superglue.
Dört inç ahşap bez sopa sonuna kadar naylon olta küçük bir uzunluk yapıştırma süper manipülatör inşa edin. Gerekirse, montajdan önce embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında dekoron. Embriyoları monte etmek için, görüntüleme odasında plastik halka nın merkezine balık transferi ve ince uçlu transfer pipet ile mümkün olduğunca fazla E üç kaldırın.
Bir yüzde düşük erime agarose ve E üç ile balık kapsayacak şekilde temiz bir transfer pipet kullanın, agarose bir tabaka ile tüm plastik halka doldurma. Sonra yavaşça pipet ucu içine embriyo çekin ve geri agarose içine herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmadan. Hızlı bir şekilde sertleşir önce balık ve agarose yönlendirmek için bir embriyo manipülatör kullanın.
Dik bir mikroskopla görüntülenirse, embriyoyu agarose'un üst yüzeyine mümkün olduğunca yakın konumlandırın ve kuyrukları düz olarak görüntüleme odasının altına paralel olduğundan emin olun. Agarose sertleşmek için bekleyin, sonra E üç ile görüntüleme odası doldurun, görüntüleme boyunca buharlaşma için mümkün olduğunca ekleyerek. Görüntüleme odasını balık ve E üçünle birlikte konfokal mikroskoba yerleştirin.
Sonra yüksek sayısal diyafram ve uzun bir çalışma mesafesi ile hedef seçin. Hücrelerin uygun şekilde yoğun ve parlak etiketleetiketlenmiş bir bölge bulun ve edinme parametrelerini ayarlayın. Bu Zen yazılımı kullanarak bir örnektir, ancak ayarlar mikroskop ve lazer hatları mevcut bağlı olarak değişir.
Her FP kanalını ardından güçlemek için üç parça hazır 458 nanometrede CFP ve 514 nanometrede YFP'yi heyecanlandırmak için argon lazer kullanın ve dTomato'yı heyecanlandırmak için DPSS 561 nanometre lazer kullanın. Uygun dalga boylarında üç için misyonları toplamak.
Görüntü ve mitotik ve apoptotik olayları izlemek için 10 ila 30 dakika arasında bir zaman aralığı z yığını aralığı seçin. Son olarak, görüntüleme oturumunun uzunluğunu seçin ve denemeyi çalıştırın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, Zen veya Fiji ile uyumlu başka bir biçim kullanıyorsanız, czi formatında ham verileri kaydedin, ardından bio formatları ithalatçısını kullanarak görüntüleri Fiji'ye aktarın.
In vivo multicolor time-lapse görüntüleme gelişmekte olan zebrabalığı hindbrain proliferatif ventriküler zonunda hücrelerin Brainbow renk kodlu klonlar göstermek için kullanılmıştır. Belirli bir radyal lif boyunca düzenlenmiş Brainbow etiketli hücreler aynı rengi paylaştı. Hangi göreli RGB kanal ağırlıkları olarak ölçülebilir.
Bu, bu radyo gruplarının bölünen hücrelerin klonları olduğunu ve benzer renklerinin onları klonsal olarak ilişkili olarak tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Kantitatif renk analizi, kız hücrelerinin annelerinin hücresiyle aynı rengi ifade ettiğini gösterdi. Ama bu komşu radyo hücre kümeleri birbirinden ayırt edilebilir.
İlgili hücrelerin çok sayıda klonları aynı anda vivo saat içinde takip edilebilir, bir multipleks soy analizi ve karşılaştırma için izin. Klonlarda renk ekspresyonunun iki de ve daha sonra üç gün sonra döllenme sonrası ölçülmesi Brainbow ifadesinin iki ila üç gün arasında nispeten sabit kaldığını göstermiştir. Hızlandırılmış görüntüleme, döllenmeden bir ila iki gün sonra interkinetik nükleer göç ve hücre bölünmesi geçiren çok sayıda hücreyi ortaya çıkararak hücre döngüsünü incelemeyi mümkün kıldı.
Zebra balığında önceki ölçümlerle karşılaştırılabilecek ortalama 8,4 saatlik bir hücre döngüsü hesaplanmıştır. Ayrıca bu görüntüleme tekniği, membran blebbing ve hücre parçalanması gibi apoptoz ile ilişkili stereotipik morfolojik değişiklikleri geçiren hücreleri tek tek gözlemlemek için kullanılmıştır. Bu yöntem in vivo olarak yapıldığından, zebra balıkları görüntüleme odasından kurtarılabilir ve daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme veya diğer deneyler için muhafaza edilebilir.
Bu tekniğin kullanımı bize nöral gelişim sırasında klonsal ilişkili hücrelerin rolleri hakkında yeni sorular keşfetmek için izin verir.
