Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla dinamica delle cellule progenitrici neurali e sulla loro progenie che sono alla base dello sviluppo cerebrale dei vertebrati. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di visualizzare direttamente più ammassi di cellule correlate alla clonally all'interno del cervello vivente per molte ore di sviluppo. Il protocollo può anche essere applicato allo studio della dinamica clonale e progenitrice in altri sistemi in via di sviluppo dell'embrione zebrafish.
La visualizzazione utilizzando questo metodo è particolarmente utile per osservare direttamente i processi fondamentali che si verificano durante lo sviluppo neurale. Il pomeriggio prima di eseguire micro iniezioni, impostare zebrafish adulti di tipo selvatico in vasche di accoppiamento segregate per il sesso. La mattina seguente preparare la soluzione di DNA secondo le indicazioni manoscritte e iniettare circa 4,2 nano litri di questa soluzione in embrioni di zebrafish a una cellula entro 45 minuti dalla fecondazione.
Mantenere gli embrioni iniettati in E tre mezzi e un incubatore di 28 gradi Celsius per 24 ore, quindi chiamare gli embrioni morti e deformati dal gruppo. Trasferire fino a 20 embrioni sani in un tubo da 50 millilitri, riempirlo con 10 millilitri di E tre e posizionare un cappuccio sopra ogni tubo. Posizionare un rack con i tubi da 50 millilitri in posizione verticale in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 80-90 minuti, assicurandosi che il livello dell'acqua nel bagno sia superiore ai tre E nel tubo.
Rimuovere il portatubi dal bagno d'acqua e posizionarlo nell'incubatore di 28 gradi Celsius. Lasciare raffreddare fino a un'ora affinché l'E tre si raffredda e gli embrioni si riacclimatino alla temperatura. Quindi trasferirli a piastre di Petri con PTU da 0,2 millimolare ed E tre tenuti caldi nell'incubatore di 28 gradi Celsius.
A due o quattro ore dopo lo shock termico, esaminare gli embrioni sotto un microscopio standard a dissezione a fluorescenza per l'espressione della PCP o dell'YFP che indica una ricombinazione riuscita di Brainbow. Seleziona embrioni con una robusta espressione FP e trasferiscili in un piatto separato con PTU. Immaginili uno, due o tre giorni dopo la fecondazione.
L'espressione che appare fioca al microscopio a fluorescenza può effettivamente essere ben visualizzata nell'imaging confocale time-lapse. Prima del giorno dell'esperimento, preparare la camera di imaging e lo strumento di manipolazione degli embrioni. Per preparare la camera di imaging, sovraincollare con cura un anello di plastica al centro di una piastra di Petri di 60 millimetri.
Costruisci il manipolatore incollando super una piccola lunghezza di lente di pesca in nylon fino alla fine di un bastone da tampone di legno da quattro pollici. Se necessario, dechorionare gli embrioni al microscopio a dissezione prima del montaggio. Per montare gli embrioni, trasferire il pesce al centro dell'anello di plastica nella camera di imaging e rimuovere il maggior numero possibile di E tre in eccesso con una pipetta di trasferimento a punta fine.
Utilizzare una pipetta di trasferimento pulita per coprire il pesce con un agarosio a bassa fusione dell'uno per cento ed E tre, riempiendo l'intero anello di plastica con uno strato di agarosio. Quindi tirare delicatamente l'embrione nella punta della pipetta e tornare nell'agarosio senza introdurre bolle d'aria. Utilizzare un manipolatore di embrioni per orientare rapidamente il pesce e l'agarosio prima che si indurisca.
Se si imaging con un microscopio verticale, posizionare l'embrione il più vicino possibile alla superficie superiore dell'agarosio, assicurandosi che siano paralleli al fondo della camera di imaging con la coda dritta. Attendere che l'agarosio si indurisca, quindi riempire la camera di imaging con E tre, aggiungendo il più possibile per tenere conto dell'evaporazione nel corso dell'imaging. Posizionare la camera di imaging con il pesce ed E tre al microscopio confocale.
Quindi selezionare l'obiettivo con un'apertura numerica elevata e una lunga distanza di lavoro. Trovare un'area con un'etichettatura delle celle appropriatamente densa e luminosa e impostare i parametri di acquisizione. Questo è un esempio utilizzando il software Zen, ma le impostazioni varieranno a seconda del microscopio e delle linee laser disponibili.
Prepara tre tracce per l'immagine sequenziale di ogni canale FP. Usa un laser argon per eccitare CFP a 458 nanometri e YFP a 514 nanometri e usa un laser DPSS da 561 nanometri per eccitare il dTomato. Raccogli le missioni per i tre alle lunghezze d'onda appropriate.
Selezionare l'intervallo di stack Z da immagine a immagine e un intervallo di tempo compreso tra 10 e 30 minuti per tenere traccia degli eventi mitotici e apoptotici. Infine, selezionare la lunghezza della sessione di imaging ed eseguire l'esperimento. Al termine dell'imaging, salvare i dati grezzi in formato CZI se si utilizza Zen o un altro formato compatibile con Fiji, quindi importare le immagini nelle Fiji utilizzando l'importatore di formati bio.
L'imaging time-lapse multicolore in vivo è stato utilizzato per mostrare cloni di cellule codificati a colori Brainbow nella zona ventricolare proliferativa del hindbrain zebrafish in via di sviluppo. Le cellule etichettate Brainbow disposte lungo una particolare fibra radiale condividevano lo stesso colore. Che può essere quantificato come i pesi relativi del canale RGB.
Ciò suggerisce che questi gruppi radio erano cloni di cellule divisorie e che il loro colore simile poteva essere usato per identificarle come correlate alla clonally. Un'analisi quantitativa del colore ha mostrato che le cellule figlie esprimono lo stesso colore della cellula della madre. Ma che i vicini gruppi radio di cellule possono essere distinti l'uno dall'altro.
Numerosi cloni di cellule correlate possono essere seguiti simultaneamente nel corso delle ore in vivo, consentendo un'analisi e un confronto del lignaggio multiplex. La quantificazione dell'espressione del colore nei cloni a due e poi di nuovo a tre giorni dopo la fecondazione ha mostrato che l'espressione di Brainbow è rimasta relativamente costante da due a tre giorni. L'imaging time-lapse ha rivelato numerose cellule sottoposte a migrazione nucleare intercinetica e divisione cellulare da uno a due giorni dopo la fecondazione, rendendo possibile lo studio del ciclo cellulare.
È stato calcolato un ciclo cellulare medio di 8,4 ore che è paragonabile alle precedenti misurazioni nel pesce zebra. Inoltre, questa tecnica di imaging è stata utilizzata per osservare singole cellule sottoposte ai cambiamenti morfologici stereotipici associati all'apoptosi, come l'affglieramento della membrana e la frammentazione cellulare. Poiché questo metodo viene eseguito in vivo, il pesce zebra può essere salvato dalla camera di imaging e mantenuto per l'imaging o altri esperimenti in tempi successivi.
L'uso di questa tecnica ci consente di esplorare nuove domande sui ruoli delle cellule correlate alla clonally durante lo sviluppo neurale.
