使用此协议，研究人员可以识别新的外膜或细胞外囊泡为基础的和组织为基础的微细胞为晚期前列腺癌。从F-F-B组织和细胞外囊泡中隔离RNA通常是具有挑战性的，因为大部分RNA要么被去创造，要么数量有限。下一代测序为了解肿瘤分子变化提供了最全面的平台，该粒子利用前列腺癌临床样本进行了优化，并可对晚期侵略性前列腺癌的基础生物学提供新颖的见解。
从低输入材料优化 C-D-N-A 库是成功测序运行的关键步骤，因此生成高质量的 C-D-N-A 库以获得准确结果非常重要。在进行组织进行微解剖后，如以前一样，在四摄氏度下进行分离，分离出的E-V的Thaw系列患者血清样本。将110微升解冻血清样品转移到一个管子上，在两千次G下旋转30分钟。
选择超纳登进行后续的E-V或外体分离，并丢弃德布里颗粒。在30微莱特血清外显体分离试剂到超级纳蒂。孵育它四摄氏度的三十分钟。
在一万次 G 下旋转十分钟。在单独的 1.5 毫升管中仔细选择 E-V 超级纳登，而不干扰颗粒，并储存零下 80 摄氏度以进行未来分析。然后在70微升P-B-S中重新悬浮在无核酸酶无水中准备的E-V颗粒。
从微解剖组织中隔离总 R-N-A 后，使用商业套件纯化 E-V 将 5 微升的正态 40nogram R-N-A 样品以 3 个素适配器的微升进行 5 微升的规范化 40n1。将热循环器预热至 70 摄氏度，并孵育样品两分钟。立即将样品转移到冰上。
在一个单独的管混合两微升结扎缓冲液，一微升的RNase抑制剂和一微升的T4RNA连结两，一个删除突变体。上下混合馅饼床上用品。然后将四微升的混合物加入管子，在冰上使用 R-N-A 3 素适配器。
将热循环器预热至 28 摄氏度。将管子放在热循环器中孵育一小时。之后，将一微升止损溶液加入管中，同时将样品留在热循环器上。
在28摄氏度下再孵育15分钟。然后立即取出管子，并留在冰上。在单独的管中添加五个素适配器的一微升。
转移到预热至 70 摄氏度的热循环器。孵育两分钟立即将管子放在冰上，以防止适配器重新连接。
在 D 性质五个素适配器的管中加入一微升十毫摩尔 A-T-P。混合再见馅饼撒尿，并添加一微升的T4 R-N-A连接到混合。混合再见馅饼撒尿。
将该混合物的三微升转移到包含三个主要适配器的管内，连接 R-N-A。将管子放在已预热至 28 摄氏度的热循环器上，并孵育一小时。之后，立即将管子转移到冰上，然后继续处理样品，或在零下80摄氏度下储存，供将来使用。
要执行 R-T-P-C-R，请使用每个适配器的六个微 liger 连接 R-N-A，并为此添加一个 R-N-A R-T 底土微 liger。将管子转移到预热至 70 摄氏度的热循环器，并孵育两分钟。将管子转移到冰上。
在一个单独的管混合两微升5X，股缓冲液，5微升12.5米利莫勒DFT的，一微升100米利摩尔DTT，一微升的R-N-A抑制剂，和一微升的逆转录酶。将这种混合物的五微升加入适配器连接的RNA，并将其转移到已预热至50摄氏度的热循环器中孵育一小时。一小时后，适配器立即将免费DNA连接到冰上。
在单独的管中，混合25微升PCR混合物、2微升RNA PCR底材、2微升RNA PCR素板指数和8.5微升RNA自由水。将 37.5 微升添加到适配器连接 CDNA 的 12.5 微升中。将管子转移到预热至 98 摄氏度的热循环器。
按照制造商协议中的建议对热循环器进行编程，将循环编号修改为 15。完成后，将样品保持在摄氏四度。继续或储存在零下80摄氏度，供将来使用。
要净化连接的免费DNA，请在每个免费DNA样本中加入10微升的DNA加载染料。并至10微升的高分辨率后者和定制RNA后者。在 6% 的 TBE 聚丙烯酰胺凝胶中，在每个单独的通道中运行每个样品的 30 微升。
与自定义RNA后和高分辨率后，中间空间之间的两个不同的样品。在一个 X TBE 缓冲液中以 145 伏运行凝胶约 30 至 40 分钟。跟踪装载染料的下蓝色前部。
当电泳接近凝胶底部时，停止电泳。将凝胶转移到一个 X TBE 缓冲液中，每毫米溴化乙基 5 微克。在转光器中可视化凝胶，在 145 基对和 160 基对标记之间精确切割凝胶，并略高于 145 基对标记，以避免适配器二丁体污染。
关键的一步是纯化连接CDNA，它通过切割凝胶精确，因为适配器二丁字运行非常失去所需的品牌。将凝胶片转移到保存在两毫米收集管中的DNA破碎管中。在两万次 G 下旋转两分钟。
并添加三百微升无 RNase 水，并允许它在室温下在摇杆上轻轻旋转过夜。第二天进行DNA沉淀，将管内物转移到5微米过滤管。旋转 600 次 G 严格十秒钟。
然后加入两微升的糖原三十微升三摩尔醋酸钠、1X 颗粒漆和 975 微升的 100% 乙醇，以洗脱 DNA。在 4 摄氏度下旋转 17，000 次 G，旋转 20 分钟。丢弃上一液，加入75%的乙醇来清洗颗粒。
在4摄氏度的17000倍G下旋转5分钟后，丢弃上经液，在37摄氏度的热块上孵化管子，将乙醇完全蒸发。在PH 8.5下，用12微升的10毫摩尔氯化三氯乙烯重新悬浮颗粒。接下来，通过稀释纯化和免费DNA十次，并使用稀释的CDNA的一微升在生物分析器上运行，执行库质量检查。
确保免费DNA产品大小对应于电谱中136到160个碱基对之间的小RNA范围。计算每个样本的总摩尔度。使用 PH 8.5 的三盐酸盐使每个样品标准化为 2 纳米摩尔。
通过将两个纳米摩尔样品的等量混合到一个两百微升 PCR 管中，来保持库。遵循手稿中描述的步骤的变性和顺序。在这项研究中，该库是在RNA分离和进行质量检查后编写的。
适配器连接微 Rnase 的产品大小对应于每个样品约 136 到 160 个基对。突出显示的部分显示了为制备的小RNA库精确切除的凝胶范围。此图显示了纯化免费 DNA 库的凝胶电泳和电图。
微解剖FFPE组织和血清衍生EV的。小型RNA测序运行的代表性指标显示了预期的聚类密度、Q评分、聚类通过滤波器百分比，以及微解剖FFP组织和血清衍生EV的估计产量和误差率。两个样本中的 Q 分数显示高于 3 的值，表示基本呼叫精度的 99.9%。
误差率都低于1。图书馆准备的每一步都应认真执行，每次孵化后，应立即将管子转移到冰中。协议中的一个关键步骤是精确切割凝胶，以确保您拥有无适配器的、纯的 CDNA 库。
生成 CDNA 库需要优化，以进行高质量的测序运行。了解此协议将有助于观看者从有限源样本中推断出这些微小细节到其他测序库准备，以表明血清和细胞外囊泡。这项技术帮助我们识别出与转移性前列腺癌患者相关的肿瘤攻击性和治疗耐药性的新微鼻。
这些技术可以推断到其他疾病类型，可以帮助小说生物标志物的发现。由于该技术使用生物材料，如条纹衍生血清和组织样本，应采取适当的预防措施。此外，溴化乙基是一种已知的致癌物质，应使用本议定书非常谨慎地处理。
