Bu protokol, testis morfogenezinin incelenmesi nde ve yüksek tropo ilaç ve toksisite taramalarında kullanılabilen testis organoidlerinin nesline izin verdiği için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, son derece tekrarlanabilir olması, nispeten düşük sayıda hücre gerektirmesi ve testis-spesifik mimariye sahip çok sayıda testis organoidi oluşturmak için kullanılabilmesidir. Bu yöntem pluripotent kök hücreler veya gerekli optimizasyonlar ile pankreas adacık hücreleri gibi diğer sistemleri, çalışma için uygulanabilir.
Testis dokusu enzimatik sindirim prosedürünü gösteren Anna Voigt, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak. Steril bir kabın içine testis toplamak ve% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile yıkayın. Yıkadıktan sonra testis% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile 100 milimetrelik doku kültür çanak aktarır.
Tunica vaginalis ve epididim kaldırmak için otoklav makas ve forseps kullanın. İzole testisi yeni bir 100 milimetrelik tabağa aktarın ve %1 penisilin streptomisin içeren PBS ile iyice yıkayın. Doğrudan tunica altında uzunlamasına eksen boyunca testis kesin.
Daha sonra iki forseps kullanarak tunica testis soyma ve 1% penisilin streptomisin ile DMEM 1 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre lik çanak içine yerleştirin. Bir ila iki milimetrelik doku parçaları halinde steril makas ile soyulmuş testis kıyma. Doğrama sonra bağ dokusunun beyaz parçaları kaldırmak için steril forceps kullanın.
50 mililitrelik bir tüpiçinde a çözeltisine kıyma doku parçalarını aktarın ve colagenaz 4S için mililitre başına 0,4 miligram ve colagenase 4W için mililitre başına 0,8 miligram konsantrasyon elde etmek için DMEM ile 50 mililitreye kadar yerleştirin. Doku parçalarını içeren tüpü 30 dakika boyunca 37 derece su banyosuna yerleştirin. Tüpü her beş dakikada bir yavaşça ters çevirin.
30 dakika sonra tüpü 90 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede 1,5 dakika ara verin. Supernatant atın, ad 40 çözelti B mililitre, ve colagenase 4W mililitre başına 1,2 miligram konsantrasyon elde etmek için DMEM ile 50 mililitre kadar top. Tüpü 30 dakika boyunca 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirin ve tüpü her beş dakikada bir hafifçe ters çevirin.
Tüpü 90 kez G'de 25 santigrat derecede 1,5 dakika ara verin. Bundan sonra supernatant atın ve% 1 penisilin streptomisin ile PBS ile bir kez yıkayın. Dikkatle üst ve yerden yeni bir 50 mililitretüp içine tübülleri toplamak.
50 mililitreye kadar PBS ile tüpü toplayın. 1,5 dakika boyunca 25 santigrat derece molaları ile 90 kez G boruları santrifüj. Supernatant atın ve iki ek kez yıkamak için taze PBS ekleyin.
Son PBS yıkama dan sonra supernatant kaldırmak ve pbs beş mililitre seminiferous tübülleri yeniden askıya. Daha sonra, tübüllere %0,25 Tripsin EDTA 15 mililitre ekleyin. Tüpü 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirin ve her iki dakikada bir hafifçe ters çevirin.
Beş dakika sonra bir doku kültürü plaka üzerinde örnek 10 mikrolitre ile mikroskop altında tek hücrelere tübüllerin enzimatik sindirim değerlendirmek. Her iki dakikada bir gözlemlemek için örneği mikroskop altına yerleştirin. Çoğunlukla tek hücreler tespit edilebilirse, reaksiyonu beş mililitre FBS ile durdurun ve 70 mikronluk bir kafesten ve ardından 40 mikronluk bir ağdan filtreleyin.
Tek hücreleri 500 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede beş dakika ara verin. 50 mililitre zenginleştirme ortamında yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak canlı hücre sayısını sayın. Bu başlangıç hücre nüfusunun 20 milyonunun iki ultra düşük eki 100 milimetre Petri kabının her birine aktarılması ve iki gün boyunca %5'i karbondioksit ve %21 oksijen le 37 santigrat derecelik bir doku kültürü kuluçka makinesine inkübatın.
Cede 20-25 milyon hücre kalan başlangıç hücre nüfusunun 100 milimetre doku kültürü çanak başına zenginleştirme orta toplam hacmi. Bir kuvöz içine çanak yerleştirin ve 1,5 saat sonra Sertoli hücrelerinin çoğunluğu plaka bağlı olduğundan emin olun. Süpernatants'ı toplamak ve birleştirmek için iki plakayı hafifçe yatırın ve 100 milimetrelik yeni bir plakaya yerleştirin ve kuvöze geri yerleştirin.
Bir saat sonra, yine yeni bir 100 milimetreplaka için iki plaka supernatants birleştirir. Tabakları bir gecede kuvöze geri yerleştirin. Sonra iki fraksiyonu, non-yapışık fraksiyonu ve biraz yapışık fraksiyonu zenginleştirilmiş mikrop hücreleri toplamak.
Non-adherent fraksiyonu olarak supernatant toplamak. Hafif yapışkan fraksiyonu için pbs ile yavaşça plakaları yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 0,25% Trypsin EDTA 0,25% seyreltme bir iki mililitre ile tedavi. Zenginleştirme orta iki mililitre ekleyerek reaksiyonu durdurun ve non-adherent fraksiyonu tüp toplamak.
Başlangıç hücre preparatını ve zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini bir tüpte birleştirerek %25'lik mikrop hücresi içeren bir çalışma hücresi preparatını elde edin. 500 kez G'de santrifüj ve 25 santigrat derecede beş dakika mola verin. Supernatant atın ve mililitre başına 2.4 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşmak için organoid oluşumu orta 20 mililitre hücreleri yeniden askıya.
Yeni bir tüp hücre içeren çözeltinin bir mililitre ekleyin. Mikro kuyu plakasındaki her kuyuya 0,5 mililitre yüzey aktif madde durulama çözeltisi ekleyin. Hiçbir hava kabarcıkları kuyuda sıkışıp olduğundan emin olun.
Hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı 2,000 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede iki dakika ara verin. Kabarcıkların mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için düşük büyütmeli ters mikroskop altında plakayı gözlemleyin. Tabağı kapaklı olarak kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Tedavi tamamlandıktan sonra durulama çözeltisini çıkarın ve hemen tabağı steril su veya PBS ile yıkayın. Her kuyuya 0,5 mililitre organoid formasyon ortası ekleyin ve 2,000 kez G'de 25 santigrat derecede iki dakika mola lar ile kapana kısılmış hava kabarcıklarını temizleyin. Hava kabarcıkları kaldırılmış olduğunu doğrulamak için düşük büyütme ters mikroskop altında kuyu gözlemleyin.
Çalışma hücresi süspansiyon0,5 mililitre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın. 500 kez G'de santrifüj ve 25 santigrat derecede beş dakika mola verin. Hücrelerin mikro kuyularda kümelendiğini doğrulamak için ters bir mikroskop kullanın.
Plakayı beş gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine ve kültüre aktarın. Her gün ortamın yarısını değiştirin. Organoidler kurtarmak için yavaşça orta yukarı ve aşağı pipet için geniş ağızlı pipet kullanın.
Bu organoidler mikro kuyular çıkmak için izin verir. Organoidleri toplayın, germ hücre belirteci, Sertoli hücre belirteci, peritübüler miyoid hücre belirteci ve Leydig hücre belirteci için immün omünokimyayı düzeltin ve gerçekleştirin ve konfokal mikroskop altında görselleştirin. Bu çalışmada, mikro kuyularda kendi kendine düzenlenmiş ve farklı dış ve iç bölmeleri ile küresel olarak organize edilen bir haftalık domuz testislerinden izole edilmiş hücreler.
İki bölme kollajen IV pozitif bazal membran ile ayrılmıştır. GATA4 pozitif Sertoli hücreleri ve UCHL1 pozitif mikrop hücreleri bodrum zarının dış bölmesinde ydi. aSMA pozitif peri-tübüler miyoid hücreler bodrum zarının iç boyunca lokalize edildi cyp450 pozitif Leydig hücreleri interstitium merkezinde idi.
Bu yapı, Leydig hücrelerinin, peri-tübüler miyoid hücrelerinin interstisyumda, interstisyel bölmede ve mikrop hücrelerinde yer aldığı Situ koşullarına benzer, Sertoli hücreleri seminiferous epitelde bulunur. Organoid ler üretmek için kullanılan hücrelerin optimum kaliteye sahip olmasını sağlamak önemlidir. Enzimatik sindirimin tripsinizasyon aşamasında dikkatli olunmalıdır.
Bu prosedürü takiben organoidler germ-hücre farklılaşmasını incelemek veya gen ekspresyonu ve salgılanan protein ler veya hormonlar için analiz etmek için uzun vadeli kültürlenebilir. Testis-spesifik hücre çağrışımları ile organoidler oluşturma yeteneği testis gelişimi ve germ hücre fonksiyonu için önemli hücre-hücre etkileşimleri çalışma için yeni bir in-vitro sistem sağlar.
