هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لتوليد organoids الخصية، والتي يمكن استخدامها كمنصة لدراسة morphogenesis الخصية و لارتفاع الأدوية تروبو والفحوصات السمية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للاستنساخ للغاية، وتتطلب عدداً منخفضاً نسبياً من الخلايا، ويمكن استخدامها لتوليد عدد كبير من الأعضاء الخصية مع بنية الخصية المحددة. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أنظمة أخرى، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو خلايا جزر البنكرياس مع التحسينات اللازمة.
مما يدل على إجراء الهضم الانزيمية الأنسجة الخصية سيكون آنا فويغت، طالبة دكتوراه من مختبري. جمع الخصية في منقار عقيمة ويغسل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ ستريبتوميسين البنسلين. بعد غسل نقل الخصية إلى 100 ملليمتر طبق زراعة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ من البنسلين ستريبتوميسين.
استخدام مقص autoclaved والملقط لإزالة tunica المهبل وepdidymis. نقل الخصية المعزولة إلى طبق جديد 100 ملليمتر وغسلها جيدا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ البنسلين ستريبتوميسين. قطع الخصية على طول المحور الطولي مباشرة تحت tunica.
ثم قشر الخصية من tunica باستخدام اثنين من ملقط ووضعها في طبق جديد 100 ملليمتر تحتوي على 1 ملليلتر من DMEM مع 1٪ ستيربتوميسين البنسلين. اِنُمَمُق الخصيتين المقشرة بمقص معقمة إلى قطعة من الأنسجة إلى 2 ملليمتر. بعد التقطيع استخدام ملقط العقيمة لإزالة شظايا بيضاء من النسيج الضام.
نقل قطع الأنسجة المفروم إلى حل A في أنبوب 50 ملليلتر وأعلىه تصل إلى 50 ملليلتر مع DMEM للحصول على تركيز 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر لكولاجيناز 4S وتركيز 0.8 ملليغرام لكل ملليلتر لكولاجيناز 4W. ضع الأنبوب الذي يحتوي على قطع الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عكس بلطف أنبوب كل خمس دقائق.
بعد 30 دقيقة، الطرد المركزي الأنبوب في 90 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. تجاهل supernatant، 40 ملليلتر من حل B، وأعلى تصل إلى 50 ملليلتر مع DMEM للحصول على تركيز 1.2 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجيناز 4W. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وعكس الأنبوب بلطف كل خمس دقائق.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 90 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. بعد ذلك تجاهل supernatant، وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مع 1٪ البنسلين ستريبتوميسين. جمع بعناية الأنابيب من أعلى ومكان في أنبوب جديد 50 ملليلتر.
أعلى أنبوب مع برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنابيب في 90 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. تجاهل supernatant وإضافة برنامج تلفزيوني جديد لغسل مرتين إضافيتين.
بعد غسل برنامج تلفزيوني الماضي إزالة فائقة وإعادة تعليق الأنابيب seminiferous في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة 15 ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى الأنابيب. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية وعكسه بلطف كل دقيقتين.
بعد خمس دقائق تقييم الهضم الأنزيمي من الأنابيب إلى خلايا واحدة تحت المجهر مع 10 ميكرولترات من عينة على لوحة ثقافة الأنسجة. كل دقيقتين ضع العينة تحت المجهر لمراقبة. إذا كان في الغالب يمكن الكشف عن خلايا واحدة وقف التفاعل مع خمسة ملليلتر من FBS وتصفية من خلال شبكة 70 ميكرون ومن ثم من خلال شبكة 40 ميكرون.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا الفردية في 500 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق في 50 ملليلتر من متوسطة التخصيب، وعد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الهيموسيت. نقل 20 مليون من هذه الخلية بدءا من كل من اثنين من مرفق منخفضة للغاية 100 ملليمتر أطباق بيتري واحتضان في حاضنة الأنسجة والثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ الأكسجين لمدة يومين.
Cede 20 إلى 25 مليون خلية من الخلايا المتبقية بدءا من كل 100 ملليمتر طبق زراعة الأنسجة في حجم إجمالي قدره ثمانية ملليلتر من متوسط التخصيب. ضع الطبق في حاضنة وبعد 1.5 ساعة تأكد من أن معظم خلايا سيرتولي متصلة باللوحة. إمالة قليلا اثنين من لوحات لجمع والجمع بين عظمى في لوحة واحدة جديدة 100 ملليمتر ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
بعد ساعة واحدة، مرة أخرى الجمع بين عظمى من اثنين من لوحات إلى لوحة جديدة 100 ملليمتر. ضع اللوحات مرة أخرى في الحاضنة بين عشية وضحاها. ثم جمع الخلايا الجرثومية المخصب في شقين، غير المنضمين جزء وجزء انتصـر قليلا.
جمع المناط ككسر غير الملتزم. لكسر مُلتَمَى قليلاً يغسل الأطباق بلطف مع برنامج تلفزيوني ويعامل بمليلترين من 1 إلى 20 تخفيف 0.25٪ تريبسين EDTA لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وقف رد الفعل عن طريق إضافة مليلترين من متوسطة التخصيب وجمع في أنبوب كسر غير الملتزم.
الجمع بين إعداد خلية البداية والخلايا الجرثومية المخصب في أنبوب للحصول على إعداد خلية العمل التي تحتوي على 25٪ من الخلايا الجرثومية. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من الخلايا المُتسرّعة وإعادة تعليقها في 20 ملليلترًا من تشكيلات أعضاءية متوسطة للوصول إلى تركيز 2.4 مليون خلية لكل ملليلتر.
في أنبوب جديد إضافة ملليلتر واحد من الحل الذي يحتوي على خلايا. إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الشطف السطحي لكل بئر في لوحة صغيرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في البئر.
لإزالة فقاعات الهواء الطرد المركزي لوحة في 2،000 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. مراقبة لوحة تحت المجهر المقلوب التكبير المنخفض للتحقق من أن فقاعات قد أزيلت من الآبار الصغيرة. غطي الطبق بغطاء ويحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد العلاج هو كامل إزالة محلول الشطف وعلى الفور غسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 ملليلتر من تشكيل الجهاز المتوسط لكل بئر والطرد المركزي في 2، 000 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين لإزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين. مراقبة البئر تحت المجهر المقلوب التكبير المنخفض للتحقق من أن فقاعات الهواء قد أزيلت.
إضافة 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية العاملة ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. استخدم مجهر مقلوب للتحقق من أن الخلايا قد تجمعت داخل الآبار الدقيقة.
نقل لوحة في حاضنة ثقافة الخلية والثقافة لمدة خمسة أيام. تغيير نصف المتوسط كل يومين. لاسترداد organoids استخدام ماصة واسعة الفم إلى ماصة بلطف المتوسطة صعودا وهبوطا.
وهذا يسمح organoids للخروج من الآبار الصغيرة. جمع organoids، وإصلاح وتنفيذ الكيمياء المناعية لعلامة الخلية الجرثومية، علامة الخلية Sertoli، علامة الخلية المايويد peritubular وعلامة خلية Leydig وتصور تحت مجهر confocal. في هذه الدراسة عزل الخلايا من الخصيات porcine لمدة أسبوع واحد التي كانت مثقفة في الآبار الصغيرة ذاتية التنظيم في spheroids مع المقصورات الخارجية والداخلية المبينة والمميزة.
تم فصل المقصورتين من قبل الكولاجين الرابع غشاء الطابق السفلي إيجابية. وكانت خلايا سيرتولي الإيجابية والخلايا الجرثومية الإيجابية UCHL1 في المقصورة الخارجية على غشاء الطابق السفلي. aSMA إيجابية خلايا myoid محيط أنبوبي كانت مترجمة على طول داخل غشاء الطابق السفلي بينما كانت خلايا CYP450 Leydig إيجابية في وسط الخلية.
هذا الهيكل مشابه لظروف في الموقع ، حيث تقع خلايا Leydig ، الخلايا myoid حول أنبوبي ، في الخلية ، في المقصورة الخلالية والخلايا الجرثومية ، تقع خلايا سيرتولي في ظهارة شبهية. من المهم التأكد من أن الخلايا المستخدمة لتوليد الأعضاء لديها نوعية مثالية. وينبغي إيلاء اهتمام دقيق خلال مرحلة التربسينية من الهضم الأنزيمي.
بعد هذا الإجراء يمكن أن تكون organoids مثقفا على المدى الطويل لدراسة تمايز الخلايا الجرثومية أو تحليل للتعبير الجيني والبروتينات أو الهرمونات المفرزة. القدرة على خلق organoids مع الخصية المحددة اقترانات الخلايا يوفر رواية في المختبر نظام لدراسة التفاعلات الخلية الخلية الهامة لتطوير الخصية ووظيفة الخلية الجرثومية.
