Bu videoda, optik nöronlarda eksojen DNA yapılarının nasıl ifade edilebildiğini ve gfp ifade eden optik aksonal çardakların sağlam, yaşayan Xenopus laevis kurbağa yavrularında nasıl görüntüleneceğini gösteriyoruz. Bu, yaşayan bir omurgalı model sisteminde gelişen, bireysel optik aksonal çardaklarda hücre özerk gen fonksiyonunun belirlenmesine olanak sağlayan geçici hücreye özgü transgenez için ucuz ve basit bir prosedürdür. Prosedürü gösteren ben, Sophia Dao, Araştırma Görevlisi ve Dr Tamira Elul, Laboratuvar Baş Müfettiş i olacak.
Başlamak için, hafifçe ince forceps ile çekilen cam mikro kılcal pipet ucu klip. Cam mikro kılcal pipeti mineral yağ ile microfil kullanarak, mikro pipetin kırpılmış ucunda küçük bir damla mineral yağ belirir şekilde doldurun. Cam mikro kılcal pipeti yarı yolda mineral yağ ile doldurun.
Bir enjektörde, pistonu yarıya doğru fırlatın ve çekilen cam mikro kılcal pipeti enjeksiyon tutucuya yükleyin. Daha sonra mikro kılcal pipetin enjektöre güçlü bir şekilde bağlı olduğunu ve pistonun uzantısı ile hareket etmediğini doğrulamak için pistonu tam ölçüde genişletin. DNA/DOTAP karışımının üç mikrolitrelik damlasını bir inç karelik bir kağıt parçasına aktarın.
Stereo diseksiyon mikroskobu altında, cam mikro kılcal pipetin ucunu DNA/DOTAP damlasına taşıyın. Enjeksiyon aparatı üzerindeki dolgu seçeneğini kullanın, DNA/DOTAP damlasını cam mikro kılcal pipete yavaşça emerek. Mineral yağ ile DNA/DOTAP çözeltisi arasındaki sınır, DNA/DOTAP çözeltisinin hafif opaklığı nedeniyle cam mikro kılcal pipette görülebilir.
Gerekirse, cam mikro kılcal pipetbasıncının yeniden ayarlanabilmesi için mikro kılcal pipetin düzenli olarak doldurulmasını bekleyin. İlk olarak, 0.1X MMR ile dolu 10 mililitrelik Petri kabında, 10 etap 20-24 Xenopus embriyolarını ince çiflips ile elle de-vitellinize. Embriyoların yaralanmasını önlemek için beldeki vitellinzarfı kavrayın.
Deneycinin sol ve sağ elindeki forsepslerle vitellin zarfının balonunu patlatın ve embriyoyu vitellin zarfından serbest bırakın. Vitellin zarfını çıkarırken embriyoları yaralamamaya dikkat edin. Daha sonra 1X MMR ile dolu 10 mililitre Petri kabına beş ila 10 de-vitellinized sahne 22-24 embriyolar aktarmak için bir kesme ucu ile plastik bir transfer pipet kullanın.
Stereo mikroskop altında, Petri kabındaki vitellinize edilmiş embriyolardan birini forceps ile tutun ve embriyoyu ön kutbunun görüş alanına doğru işaret edin şekilde düzenleyin. Daha sonra embriyoyu yanal bir şekilde yatacak şekilde yönlendirin ve soldan sağa doğru tomurcuklarından biri yukarı bakacak şekilde. Embriyoyu deneycinin baskın olmayan elindeki forsepslerle ve deneycinin baskın eliyle tutun, cam mikro pipetin ucunu ventral veya dorsal taraftan epidermisin hemen altından göz tomurcunun içine tanıtı.
DNA/DOTAP çözeltisinin 70 ila 210 nanolitresini enjekte edin. Sonra embriyo etrafında çevirmek ve embriyonun kontralateral tarafında diğer göz tomurcuk içine aynı mikro enjeksiyon gerçekleştirmek. Her deneyde altı ila 10 embriyonun her iki göz tomurcuklarını enjekte edin.
Mikro enjeksiyondan sonra, yara iyileşmesini kolaylaştırmak için embriyoları 1X MMR ile yaklaşık 30 dakika boyunca Petri kabında saklayın. 30 dakika sonra, pigmentasyonu azaltmak için enjekte edilen embriyoları plastik transfer pipeti ile %0,001 beyazlatma maddesi fenilitokarbamid ile 0,1X MMR çözeltisine aktarın. Petri kabını, embriyolar 46-47 evrelerinde iribaş haline gelene kadar yaklaşık beş gün boyunca embriyoları kültüre bir kapakla kapatın.
Bu protokol, 1 ila 10 optik aksonal arbors GFP ifade enjekte Xenopus embriyoların% 30-60 bir başarı oranı verir. GFP'nin temsili konfokal görüntüleri, sağlam Xenopus kurbağa yavrularındaki ekspres kontrolü ve mutant optik aksonal çardakları göstermektedir. APC, APCNTERM ve APBbeta-cat'in iki etki alanı mutantı pCS2 plazmidlerine klonlandı.
GFP kontrolü ve APC mutant optik aksonal arbors Z-serisi görüntüleri yeniden inşa edildi. Şube sayısı, toplam ağaç dalı uzunluğu ve ortalama dal uzunluğu çizimleri kontrol ve Aksonal arbors ifade APC mutant arasındaki gözlenen farklılıkları onaylamak. Regresyon çizgileri ile şube sayısı ve ortalama dal uzunluğu ek dağılım çizimleri bu parametreler ve APC etki alanlarını ifade optik aksonal arbors arasında ters korelasyon göstermektedir.
Mikro kılcal pipetin ucu, her mikro enjeksiyon sırasında göz tomurcuklarını örten gri epidermisin şişmesi için göz tonuna çok yüzeysel olarak yerleştirilmelidir. Bu prosedür, bu optik nöronlardan aksonların büyümesini, hedeflemesini ve dallanmalarını değerlendirirken optik nöronlarda spesifik genetik fonksiyonu etiketlemek ve değiştirmek için kullanılabilir. Bu DNA mikro enjeksiyon ve lipofection tekniği gelişimsel nörobiyoloji araştırmacılar bozulmamış optik akson arborization düzenleyen hücre özerk moleküler mekanizmaları çalışma için izin verdi, yaşayan Xenopus laevis kurbağa yavruları.
