Bu çalışma Texas McGovern Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatri Bölümü&#39;nden Sağlık NIDDK hibe (K01DK092320) ve başlangıç ​​fon Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston&#39;ın Merkezi&#39;nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi <ol><li> Embriyoların oluşturmadan önce, embriyo erken hücre bölünmeleri yönünü anlamak için Xenopus Kalkınma 21 Normal Tablo kullanın. Alternatif olarak, Xenbase 11 Xenopus erken gelişim aşamaları erişim şemaları. </li><li> Mikroenjeksiyon için hedeflenen hangi blastomere seçmek için Xenbase 11 interaktif Xenopus hücre kaderi haritalar erişin. </li><li> Tek hücreli embriyo bir koyu pigmentli hayvan kutup beyaz ve yolky bir bitkisel kutup, sahip olduğunu gözlemleyin. Not Vitellin E olarak bilinen koruyucu zar,nvelope, embriyo kapsar. </li><li> İlk bölünme genellikle embriyonun sol ve sağ taraf arasında meydana dikkat edin. Bu hücreler Pronephric soy eşit katkıda bulunur. </li><li> İkinci bölünme 4 hücreli embriyo lider, dorsal ve embriyonun ventral yarılarına ayıran unutmayın. Dorsal hücreleri daha küçüktür ve ventral hücreleri (Şekil 2A ve Şekil 3A) daha az bir pigment. <ol><li> Sol ve sağ tarafta, dorsal daha gelişen böbrek daha fazla katkıda (D; küçük, hafif hücreler) blastomer (Şekil 2A); ventral blastomer (büyük, koyu hücreler V) belirleyin. </li><li> 4 hücreli embriyo içine enjekte ise, sol böbrek (Şekil 3A ve Bölüm 3) hedef sol ventral blastomer enjekte. </li></ol></li><li> üçüncü bölge sekiz hücreli embriyonun sonucu, hayvansal ve bitkisel tarafı ikiye bölmektedir. Bu noktada, dört hayvan blastomerler [vardır sol ve sağ ventral(V1) ve dorsal (D1)], dört bitki blastomerler [sol ve ventral sağ (V2) ve dorsal (D2)] (Şekil 2B ve Şekil 3B). <ol><li> ventral, bitkisel blastomer (V2) bulun. Bu blastomer başka hücreler bu aşamada (Şekil 2B) gelişmekte böbreğe daha fazla katkıda bulunur. 8 hücreli embriyo sol böbrek hedeflemek için, sol V2 blastomer (Şekil 3B ve Bölüm 3) içine enjekte edilir. </li></ol></li><li> Dördüncü ve beşinci bölünmelerin hayvansal ve bitkisel blastomer ikiye bölmek dikkat edin. İki döl 16 hücreli embriyo ile sonuçlanan, her blastomere oluşturulur. Hücreler kendi selefi adını taşır. Örneğin, 8-hücre evresinden itibaren V2 blastomere 16 hücreli aşamada (Şekil 2C) V2.1 ve V2.2 döl yol açar. 16-hücre aşamasında V2.2 hücrenin gelişmekte olan böbrek katkıda hücrelerin çoğunluğu içerir. </li><li> Altıncı ve yedinci bölünmelerin 32 hücre Embry neden NotO. Yine, iki döl onların selefi aşağıdaki adlandırılır her blastomer, oluşturulur. Örneğin, 16-hücre evresinden itibaren V2.2 blastomere 32 hücreli aşamada V2.2.1 ve V2.2.2 yol açar. Orada hücreleri (bitkisel hayvana) A, B, C ve D olmak üzere dört sıra halinde tespit edildiği 32. hücreli aşamada alternatif bir adlandırma sistemi ve dört sütun içinde 1, 2, 3 ve 4 (şekilde dorsal) ventral için. Bu nedenle, gelişmekte olan pronephros en çok katkıda bulunan V2.2.2 blastomere, bu alternatif bir adlandırma sistemi (Şekil 2D) altında C3 adlandırılır. </li></ol> Embriyolar 2. Hazırlık <ol><li> (PH-8,0% 2 sistein, NaOH) Dejelly çözeltisinden 50 ml hazırlayın. </li><li> Standart protokollere 14&#39;e göre bir tek erkek kurbağa hem testis izole edin. 0.1 M NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO 4, 2 mM; 10 mi Testis saklama solüsyonu (1 x Marc Modifiye Ringer [MMR ile dolu bir 60 mm Petri kabı içinde testisler yerleştirinCaCl2, 5 mM HEPES, pH 8, 0.1 mM EDTA] 12,% 1 sığır serum albümini, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C&#39;de testisler saklayın. Not: Testis yaklaşık 7 saklanabilir - 4 ° C&#39;de 10 gün, ancak döllenme verimliliği testis saklanmış olan daha azalır. </li><li> Standart protokollere 14&#39;e göre yumurta elde etmek için bir dişi kurbağa sıkıştırın. 100 mm Petri kabındaki yumurta toplamak. Fazla suyu dökünüz. </li><li> o forseps ve bir jilet kullanarak Testis Depolama Çözüm ise bir testisin ¼ kesti. yumurta içeren Petri kabı testis parçasını aktarın. Testis saklanan ne kadar süredir testis, büyüklüğüne hesabına kullanılan testis bölümünün boyutunu ayarlayın ve kaç yumurta döllenir edilecektir. Genellikle yumurta bir debriyaj döller taze disseke testis 1/3 ¼ kullanın. </li><li> forseps ve bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde testis bölümünü kesmek. Yeterince 0.3x MMR eklePetri kabı + 30 mg / ml gentamisin yumurta kapsayacak. karıştırmak için çanak MMR girdap. </li><li> döllenme oda sıcaklığında gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Hayvan yarımküre (embriyonun pigmentli tarafı) etkili verimlilik üzerine embriyonun üstünde oturup unutmayın. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanılarak Petri kabı MMR çıkarın. Embriyoların karşılamak için çanak yeterli Dejelly Çözüm ekleyin. </li><li> Önümüzdeki birkaç dakika içinde, yavaşça aralıklı çanak girdap. Şu anda yemeğin Dinç sallayarak ekseni kusurlarına neden olabilir. &#160; Embriyoların jöle kat eriyecektir ve embriyolar dönen sırasında yemeğin ortasında birleştirmek olacaktır. Embriyolar yakından yemeğin ortasında birbirlerine dokunmadan sonra, bir transfer pipet yardımıyla Dejelly Çözüm kaldırın. 5 dakikadan daha uzun için Dejelly Çözüm embriyolar bırakmayın, ya da embriyolar zarar görebilir. </li><li> 0.3x 5 kez - dejellied embriyolar 3 yıkayındikkatlice dökerek veya MMR kapalı pipetleme ve yeni MMR ile çanak doldurarak MMR + 30 mg / ml gentamisin. çanak MMR tüm çıkarmayın ya da embriyolar zarar görebilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak Petri kabı herhangi bir gübresiz yumurta ya da testis parçaları çıkarın. </li><li> 14 ve 22 ° C arasında embriyolar inkübe edin. Not: düşük sıcaklıklarda yetiştirilen Embriyolar yüksek sıcaklıklarda yetiştirilen embriyolar daha yavaş gelişir. Gelişim aşamaları Zamanlama Xenbase 22 bulunabilir. <ol><li> gelişim üzerinden alanı için, bir Petri kabı içinde tek bir döllenme embriyoların yerde yarısı 14 ° C &#39;de tutulur ve bir Petri tabağına embriyoların yarısı 18 ° C&#39;de tutuldu. Bu, tek bir gübreleme 4-hücre ya da 8 hücreli embriyolara enjeksiyonu iki set sağlar. </li></ol></li></ol> Enjeksiyon Çözümleri ve Embryoların Mikroenjeksiyon 3. hazırlanması <ol><li> 0.01 içeren enjeksiyon çözeltisi hazırlayınng / nl membrana bağlı kırmızı floresan proteini (MEM-RFP) mRNA 9 embriyolar 4-hücre ya da 8-hücre aşamasına kadar olan gelişmekte iken. enjekte etmeye hazır olana kadar buz üzerinde enjeksiyon solüsyonu saklayın. </li><li> &quot;. İğne çektirmenin durumda üst hizalanmış yedek tüp üst, bir iğne çektirmenin içine yedek cam kapiller tüp 800 ısı 2. değerini ayarlayın ve 650 Press çekme değer&quot; 7 Yük çekme &quot;butonuna iğneyi çekin. Bu, tek bir 7 2 iğne yaratacak&quot; cam kapiller tüp. </li><li> Dumont forseps bir çift ile bir çekti iğne ucu kapalı snip. Not: İğneyi çekerek sonra, ucu kapalı mühürlü ve açık kesmek gerekir. İğne ucu olacak çapı daha küçük, bu kesilir iğne noktasına yakın. uç çapı Burada kullanılan mikroenjeksiyon sistemi ile enjeksiyon hacmi etkilemez, ancak daha büyük bir çapa sahip bir uç embriyo hasar olasılığı daha yüksektir. </li><li> m kaymaİğnenin sırtına icropipette pens. Sonraki, yuvanın arkasında iğne sırtına büyük delik O-halkasını slip. </li><li> madeni yağ iğne hava kabarcıkları almak için dikkatli olmak, bir 27 ölçü derialtı iğne kullanarak iğne doldurun. </li><li> piston yüklü beyaz plastik spacer büyük bir delik içine iğne oturma, mikroenjektör piston üzerine iğne Kayma. dalgıç beyaz aralama, büyük delik O-ring ve halkasında takip mikroenjektör gövdesine, en yakın küçük bir O-ring olmalıdır. halkayı sıkarak iğne sabitleyin. Düzgün güvenli olduğundan emin olmak için iğne yavaşça çekin. </li><li> iki bip kalmayana kadar basın ve mikroenjektör kontrol kutusu üzerindeki &quot;boş&quot; düğmesini basılı tutun. </li><li> Parafilm bir parça üzerine enjeksiyon solüsyonu pipetle 3 ul. Parafilm enjeksiyon solüsyonu boncuk içine iğne ucu yerleştirin. Basın ve microi düğmesine &quot;doldurmak&quot; tutunnjector kontrol kutusu iğne içine enjeksiyon çözümü çizmek için. </li><li> 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll kenetlenmek 500 mikronluk bir poliester ile kaplı bir 60 mm Petri kabı doldurmak. çanak içine 30 4-hücreli ya da 8 hücreli embriyolar - dikkatle 20 pipetle. </li><li> Saç döngüsünü 14 kullanılarak blastomer iğne karşı karşıya enjekte edilecek, böylece embriyolar manipüle. Sol böbreği hedef 4-hücreli embriyolar ya da 8 hücreli embriyo sol V2 blastomer sol ventral blastomer iğne bakacak şekilde embriyolar sıraya. </li><li> çanak her bir embriyonun seçilen blastomere içine enjeksiyon solüsyonu 10 nL enjekte edilir. Not: Petri kabı altındaki örgü embriyolar stabilize eder ve bunları stabilizasyon için saç döngü kullanılmadan enjekte sağlayan, kaymasını engeller. </li><li> Aktarım 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll ile dolu bir kültür plakasının oyuklarına embriyolar enjekte edilmiştir. Enjekte embriyo inkübeen az bir saat süreyle 16 ° C&#39;de in enjekte blastomerler iyileşmesi izin vermek. </li><li> aşama 9 (ön gastrulasyon kadar) 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin ile dolu olan yeni bir kültür plakasının yuvaları içine iyileşti embriyolar aktarın. </li><li> 40 21 - embriyolar evre 38 ulaşana kadar 22 ° C - 14 embriyolar inkübe edin. </li></ol> 4. Sabitleme ve Embriyolar immün <ol><li> MOPS / EGTA / magnezyum sülfat 50 ml hazırlamak / formaldehit Tamponu [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7.4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4,% 3.7 (h / h) formaldehid]. </li><li> bir cam şişede 40 embriyo - 20 evre 38 - Bir transfer pipeti kullanarak, 10 koydu. karıştırmak için flakon ve ters şişeye% 100 etanol içinde 10 ul% 5 benzokain ekleyin. embriyoların uyutmak için 10 dakika bekleyin. </li><li> Cam bir pipet kullanılarak şişeden MMR çıkarın. Aynı anda birden fazla şişe işleme durumunda, şişeler, 24-iyi hücre kültür plakasına dik yapılabilir. </li><li> Cam borutte, MEMFA ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. </li><li> Cam bir pipet kullanılarak şişeden MEMFA çıkarın. % 100 metanol ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın ve -20 ° C&#39;de% 100 metanol gecede embriyolar saklayın. </li><li> Hazırlama 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su-İnek Serumlu bir Albümin-Triton (PBT): 1X PBS, 2 mg / ml inek serum albümini,% 0.1 Triton X-100. </li><li> 1x PBT 1% 10 keçi serumu ile: Primer antikor solüsyonu hazırlayın fare monoklonal 5 seyreltme 4A6 antikoru, fare monoklonal antikorunun 3G8 bir 1:30 seyreltme (ara ürün uzak ve bağlantı tübüller 20 zarlarını etiket) ve 1 (proksimal tübüllerin 20 etiket lümen): tavşan poliklonal RFP antikor 250 seyreltme (MEM-RFP izli etiket). 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Seconda hazırlayınRy antikor çözeltisi:% 10 keçi serumu ile 1 x PBT, 1: 500 Alexa 488 keçi anti-fare IgG (stok konsantrasyonu 2 mg / ml; etiket 4A6 ve 3G8 etmek için) ve 1: 500 Alexa 555 keçi anti-tavşan IgG (hazır konsantrasyonu 2 mg / ml MEM-RFP tracer etiket). Mağaza 4 ° C&#39;de, folyo tüp kapsayan ışıktan korumak için. </li><li> Seçenek olarak ise, boyama sonrası, birincil ve ikincil antikorlar toplamak ve gelecekteki deneyler yeniden kullanım için 4 ° C&#39;de saklayın. Antikor yeniden kullanım için kaydedilecek ise,% 0.01 sodyum azit ekleyin. </li><li> Yerleşik protokoller 18 kullanılarak embriyolar immunostain. </li></ol> Embriyolar ve Hedeflenen Pronephric Doku Analizi 5. Görselleştirme <ol><li> Doğru blastomere 1X bir floresan stereomikroskop altında tracer floresan görüntüleyerek enjekte edildi doğrulamak için immunohistokimyasal embriyolar Ekran (bütün embriyo görmek için) ve 5X büyütme (böbrek görmek için). biz ile çok iyi bir cam levha yerleştirin embriyolar1x PBT ucu ile bir transfer pipet kullanarak dolu rf kesti. Bir saç döngü ile embriyolar işleyin. Embriyonun sol tarafında pronephros eş enjekte izleyici hediyem var sadece embriyolar kullanın (Şekil 3C, F ve Şekil 4C, F) geninin aşırı ekspresyonu veya demonte analizi için. </li><li> Bir cam şişe içinde embriyoların yerleştirilmesi ve Murray Clear flakon doldurarak: Alternatif olarak, Murray&#39;in Clear embriyolar (1 kısım benzil alkol 2 parça benzil benzoat) temizleyin. Bir cam plaka kullanarak embriyolar gözünüzde canlandırın. Not: Murray Temizle bir organik çözücü ve dikkatle ele alınmalıdır. eldiven giyin ve sadece Murray&#39;nın Clear cam şişeleri ve pipet kullanın. </li><li> 3 hafta - 2 için 4 ° C 1x PBT saklayın embriyolar. embriyoların uzun süreli depolama için, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 metanol içinde iki kez yıkanarak embriyolar dihidrat. % 100 metanol içinde -20 ° C&#39;de embriyolar saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+kidney+development:+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning.">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li><li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney.">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li><li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology.">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).</li><li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li><li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping.">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+stage+origin+of+Spemann's+Organizer:+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus.">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li><li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li><li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension.">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li><li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precocious+expression+of+the+Wilms'+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis.">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros:+A+kidney+model+making+leaps+toward+understanding+tubule+development.">The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development.</a> Xenopus Development. , 215-238 (2014).</li><li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension.">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li><li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development.">Requirement of Wnt/&#946;-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li><li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling.">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li><li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Xenopus+pronephric+system.">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12:+The+Xenopus+Pronephros:+A+Kidney+Model+Making+Leaps+toward+Understanding+Tubule+Development.">Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development.</a> Xenopus Development. , (2014).</li><li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation.">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li><li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+(LFB1)+during+Xenopus+development.">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li><li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos.">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li><li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct.">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li><li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Na+,+K+-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo.">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros 18 hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böy...

Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros 1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi 2, 3 geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olaylar. Xenopus pronephros proksimal, orta ve distal tübülleri bağlayan oluşan tek nefron içerir, ve (memeli glomerulus benzer) glomus 1, 4-6 (Şekil 1 </strong&gt;). Xenopus pronephros tek büyük nefron, bu böbrek gelişim ve hastalık süreçlerinde rol oynayan genlerin incelenmesi için basit bir model olarak uygun hale getirir. Hücre kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulan ve serbestçe Xenbase 7-11 online olarak mevcuttur edilmiştir. Aynı teknik, kalp ya da gözler gibi diğer hedef dokulara adapte edilebilir, ancak burada, gelişmekte Xenopus pronephros hedef soyu izleyicilerin mikroenjeksiyon için bir teknik açıklanmaktadır. Köken izleyiciler erken blastomere enjekte edilebilir, geliştirme sırasında bu hücre soyu görselleştirme sağlayan (vital boyaların, floresan etiketli dekstranlar, histokimyasal tespit enzimler, ve mRNA floresan proteinleri kodlayan dahil) etiketlerdir. Bu protokol MEM-RFP mRNA kodlama membran soy izleyici olarak, kırmızı floresan proteini 12 hedef kullanır. Hedeflenen Mikroenjeksiyon teknolojiBurada tarif edilen 4- ve 8 hücreli embriyolar bireysel blastomerlerin için bir dizi yöntem vasıtasıyla ilgili bir geni fazla-sentezlemek üzere gen ekspresyonunu veya eksojen RNA ile yıkmak morpholinos enjeksiyon için kullanılabilir. ventral, bitkisel blastomer içine enjekte edilerek, öncelikle embriyo pronephros gelişimsel bir kontrol olarak kontralateral pronephros bırakarak, hedeflenecektir. Bir izleyicinin ko-enjeksiyon doğru blastomere enjekte edildi doğrular ve embriyoda dokular gösterir pronephros hedeflenmesi doğrulayarak, enjekte blastomer ortaya çıktı. pronephros immün Pronephric tübüller hedef alınmıştır ne kadar iyi görselleştirme sağlar. Overekspresyonu ve demonte etkiler daha sonra bir gelişimsel kontrol olarak hizmet veren embriyo, kontralateral tarafa karşı gol olabilir ve Pronephric indeksi 13 hesaplamak için kullanılabilir. hücre kaderinin haritaların temini bu hedefli mikroenjeksiyon tekniği oth hedef dokulara kullanılmasına olanaker pronephros ve, bir floresanlı işaretleyici birlikte enjeksiyon dışında her bir dokuya hedeflenmiş mikroenjeksiyon analiz öncesi doğrulanmasına izin verir. Embriyo mikroenjeksiyon sırasında, gelişimsel sıcaklık, sıkı regüle Xenopus gelişme oranı o 14 oranda bağımlı olduğu verilmelidir. Geliştirme süresi yavaşlatılır için 4 ve 8-hücresi enjeksiyonu - (16 ° C 14) Embriyolar daha soğuk sıcaklıklarda inkübe edilmelidir. 22 ° C, evre 1 (1 hücreden) kalkınma anda 16 ° C geliştirme anda 3 yaklaşık 4 saattir sahneye iken 3 (4 hücreleri) yaklaşık 2 saattir sahneledi. Bu 22 ° C&#39;de 8 hücreli (evre 4) embriyo için bir 4-hücreli embriyo gitmek için yaklaşık 15 dakika sürer, ancak 16 ° C&#39;de yaklaşık 30 dakika sürer. Benzer bir şekilde, 22 ° C &#39;de, sadece bir 16 hücreli embriyo (Aşama 5) ilerleme için bir 8-hücreli embriyonun 30 dakika sürer. Bu kez 16 ° C&#39;de 45 dakika için artırılır.refore, embriyolar, 16 hücre aşamasına kadar ilerleme önce, 8-hücre aşamasında enjeksiyon için yeterli zaman sağlamak için embriyo gelişimi hızını yavaşlatmak için yararlıdır. Buna ek olarak, büyüme sıcaklığı hız veya böbrek tam gelişmiş kadar embriyo gelişimini yavaşlatmak için modüle edilebilir. Iribaş aşamalı Xenopus embriyoların epidermis dokusu 15 diseksiyon veya takas olmadan gelişen pronephros kolay görüntüleme için izin nispeten şeffaftır. Nedeniyle Xenopus embriyoların göreli şeffaflık, canlı hücre görüntüleme de 16,17 mümkündür. Sonra Xenopus embriyolar 18-20 gen ifadesinin manipülasyonu hedeflenen Pronephric gelişmenin değerlendirilmesinde izin 40 embriyolar - pronephros görselleştirmek için immün, orta distal proksimal ve sahnenin bağlantı tübül 38 etiket kurulan antikorlarla mümkündür tüm montaj.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin solution, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Benchtop incubator for embryos.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP plasmid</td><td></td><td></td><td>For making tracer RNA. Ref: Davidson &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7&quot; Drummond replacement tubes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Microinjection needles.</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>For breaking microinjection needle tip.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Microinjector.</td></tr><tr><td>Mineral oil, heavy</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Oil for needles.</td></tr><tr><td>27 G Monoject hypodermic needle</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micron Polyester mesh</td><td>Small Parts</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Screw thread vial</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>For fixing, staining, and storing embryos.</td></tr><tr><td>24-well cell Culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumen</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum, New Zealand origin</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 3G8 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label proximal tubules.</td></tr><tr><td>Monoclonal 4A6 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Secondary antibody to label kidney tubules.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>9 Cavity spot plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr></tbody></table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra - 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.

MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP&#39;yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir ...

Watch this Scientific Journal Video about Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney at JoVE.com

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.2K Görüntüleme.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

Video: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Gelişim Biyolojisi

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Biyoloji

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Nörobilim

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail vein injection, for example, is a well-established method by which the liver can be transfected. This manuscript describes an application of hydrodynamic principles by injection of the mouse kidney directly with plasmid DNA for kidney-specific gene expression. Mice are anesthetized and the kidney is exposed by a flank incision followed by a fast injection of a plasmid DNA-containing solution directly into the renal pelvis. The needle is kept in place for ten seconds and the incision site is sutured. The following day, live animal imaging, Western blot, or immunohistochemistry may be used to assay gene expression, or other assays suited to the transgene of choice are used for detection of the protein of interest. Published methods to prolong gene expression include transposon-mediated transgene integration and cyclophosphamide treatment to inhibit the immune response to the transgene.

This protocol describes a method to inject plasmid DNA into the mouse kidney via the renal pelvis to produce transgene expression specifically in the kidney.

Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Konfokal Analizi Kullanımı

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi