在本次综述中，我们将讨论用于研究细胞器定位和组成的成像和生化技术，以及免疫突触形成过程中观察到的细胞骨架重新排列。主动重塑的初始阶段允许B细胞增加细胞表面，并最大限度地提高在突触收集的抗原BCR复合物的数量。另一方面，当地招募的叶酸体，连同突触膜的中体，可以耦合到利索索姆分泌物，这是众所周知的，有助于提取固定抗原。
吸收抗原在内糖体隔间内进一步加工成肽，这些肽被加载到MHC II类分子上，以呈现给T帮助细胞。因此，研究与免疫突触相关的细胞体动力学对于理解B细胞如何完全激活至关重要。用固定抗原激活的B细胞的免疫荧光使我们能够遵循不同的细胞成分，以及如何招募它们到免疫突触。
B 细胞可以通过珠表面或盖玻片表面的固定抗原激活。抗原涂层珠子通过用以前用谷胱甘肽处理的氨基珠孵育特定的配体来准备，以激活氨基酸组。在 100 微升 PBS 和涡流中重新发送活性珠。
同时，在150微升PBS中加入每毫升100微克的BR配体，来准备抗原溶液。接下来，在抗原溶液中加入50微升活性珠，在4摄氏度下孵育过夜。请记住，也使用不相关的配体作为负控件。
孵育后，用PBS清洗珠子。吸上一道，用PBS代替。重复三次。
接下来，在BSA溶液的500微升中，通过重新暂停的珠子来阻断三个氨基组。最后，在70微升PBS中重新暂停珠子。要计算最终浓度，您可以使用血细胞计来计算珠子。
对于B细胞激活，使用50mL管和重新暂停细胞的浓度为150万每mL在C CLICK辅以5%胎儿牛血清。接下来，将15万个B细胞，与100微升的细胞珠混合物对应，加入到不同时间点37度的聚L-Lysine涂层盖玻片中。激活B细胞的第二种方法就是将它们播种到抗原涂层的盖玻片上。
为此，用防 BCR 和 B220 涂覆幻灯片，提高细胞粘附性。通过将抗BRC和B220加入PBS中，将最终浓度分别添加到每毫升10微克和每毫升0.5微克中，准备抗原溶液。接下来，将盖玻片放在覆盖着准膜的24个井板的盖子上，并添加40微升抗原溶液。
密封板，然后在4度孵育过夜。要开始盖玻片中的激活，请先用 PBS 清洗，然后让它们干燥几分钟。接下来，加入15万个B细胞，在37度下孵育不同的时间点。
在这两种情况下，当使用珠子或抗原涂层幻灯片激活时，我们建议从最长的时间点开始，然后继续到较短的时间点。将干盖玻片安装到显微镜幻灯片上后，您可以使用荧光或共生显微镜查看样品，具体取决于分辨率要求。使用透光对样品进行聚焦。
您应该搜索单元格和磁珠以一比一交互的字段。对于在抗原覆盖盖玻片上激活的 B 细胞，使用 100 倍目标实现更好的分辨率。对于参数，请考虑使用覆盖整个单元格的 z 堆栈。
您可以标记行为素以分隔单元格的下部和上边界。对于用抗原涂层珠激活的B细胞，并标记其为细胞器限制在一个点，首先划定两个区域:细胞区域和珠子区域。接下来，通过一个点确定位置或细胞器，并获取其定位坐标。
绘制两个向量:一个在细胞中心和细胞器之间，另一个在细胞中心和珠中心之间。测量两者的长度并测量两个矢量（现在称为 alpha）之间的角度。使用 alpha 的 Guassian 在中心和细胞中心之间使用矢量进行投影，然后通过将投影向量 a 除以 b 来计算细胞器的极性指数。
因此，介于零和一之间的极性指数表示偏振表型。介于零和减一之间的值表示非极化表型。为了确定更多分散细胞器（如异体）的极性指数，您可以使用前面提到的相同算法，更改质量中心标签坐标的细胞器局部坐标，在这种情况下，更改 lysosome。
与之前描述的分析类似，零和一之间的极性指数表示偏振表型，而零和减一之间的值表示非极化表型。要量化新突触中密切招募的每个细胞器的数量，您可以计算珠子上细胞器荧光的百分比。为此，您必须划定珠子和细胞区域，测量各自的荧光强度，然后将珠荧光除以珠子和细胞荧光之和。
您将获得与新突触接触的每个细胞器的量。或者，绘制一个与珠子相对的矩形。使用对应于细胞长度四分之一的重量，然后测量矩形内的荧光强度，并除以总荧光。
此算法将始终获得与新突触密切相关的细胞器的百分比，但不一定与接口直接接触。量化休息和激活的B细胞中与中分相关成分。简言之，我们确定三个参数。
细胞和珠子区域，以及中心位置坐标。接下来，我们定义一个围绕中心体的圆，然后从先前定义的中心运行径向轮廓分析。绘制后，确定保持最大荧光 70% 的半径。
使用此半径在中圆周围绘制一个圆圈。最后，获取中心区和细胞区感兴趣的成分的荧光密度，并划分两个值以获得荧光密度比。要测量免疫突触界面上的细胞器分布，首先确定与抗原涂层盖玻片接触的B细胞区域。
您可以标记 actin 以帮助您定义此区域。接下来，测量与幻灯片接触的区域、单元格的高度和宽度。抗原涂层盖滑面的面积是B细胞在B细胞激活时扩散的测量。
使用高度和宽度值来分隔单元格中的中心区域，该中心区域与边界之间以高度和宽度值的四分之一分隔。通常这些对应于大约三分之一的总细胞面积。最后，计算新突触中心的细胞器招募，将中心区域的荧光密度除以整个细胞的荧光密度。
此指数的正值表示新突触中心的细胞器富集。相反，负值表示外围分布。要测量在抗原涂层盖玻片上激活的 B 细胞的 z 平面上的细胞器分布，首先划定突触界面和细胞的上限。
接下来，在单元格中心绘制一条线，重新绘制图像以获取 XZ 图像。测量细胞的头部，将图像分成同一区域的10个分数，从免疫突触到细胞的上限。测量每个 z 分数中的荧光，通过将每个 z 分数的荧光除以细胞的总荧光来计算荧光百分比。
最后，绘制每个 z 分数的荧光强度百分比。分数一和二表示突触接口。下面是工作流或中点隔离过程。
每个条件使用 2000 万个 B 细胞。预处理细胞与细胞链素D和Nocodazole根据所需的协议，以促进中体分离。接下来，通过将细胞重新在 5 mL 的 TBS 缓冲液中重新暂停来观察细胞。
使用 1 mL 的 0.1 x TBS 缓冲液，辅以 8% 蔗糖，重复重复。用150微升的解液缓冲液重新填充细胞颗粒。在10，000克的温度下离心10分钟，在4摄氏度下分离细胞胶和细胞器。
小心地恢复细胞上一提液，并放在1.5 mL管的顶部。用 300 微升梯度缓冲液补充 60% 蔗糖。在4摄氏度下，在10，000克的离心机样品30分钟。
这个离心步骤对集中中心体很重要。离心后，小心地取出上经，直到到达接口。漩涡剩余的样品在管中。
在超离心管中，用0.27 mL的50%蔗糖，然后用0.27 mL的40%蔗糖，在梯度缓冲液中覆盖0.27 mL，准备不连续的蔗糖梯度。将富含中分的样品放在不连续梯度上，并校准相应适配器中每个样品的重量。在4摄氏度下以40，000克离心管1小时，加速度最小，不中断，避免扰动梯度。
离心后，仔细收集12个分数，体积相等。将示例与加载缓冲区重新发送并运行 SDS-PAGE。为了研究细胞器在免疫突触形成过程中在B细胞中的分布，我们使用2A1.6 B细胞激活了抗原涂层珠子不同的时间点。
作为对照，B细胞被含有不相关的BR配体的珠子激活。然后，我们使用免疫荧光染色，检测不同的细胞器，这些细胞器在激活时用固定抗原改变其局部性。我们在这里展示的中圆，标有阿尔法-图布林和高尔吉仪器标签与Rab6a。
在图中，我们显示中位和高尔吉器械极性在每个激活点（其中每个点表示一个细胞）的极性指数。在激活过程中，我们可以观察到，这些细胞器的极性指数达到接近1的值，这表明它们对 IS. 细胞器的招募量将增加，显示更分散分布的细胞器（如利索索姆）也可以使用极性指数进行量化。我们可以观察到，在激活时，lyososome 的极性指数将达到更积极的值，这是从招募到 IS 的结果。我们展示一种补充方法，用于量化向免疫突触的糖体的招募。
使用与抗原涂层珠相同的激活协议，通过量化在珠周围或突触区域内招募的解酶体的荧光标签来计算对 IS 的解酶体招募。我们可以观察到打开激活。与突触的位点耦合的利索索姆有增加。
在这里，我们介绍用特异性和非特异性抗原涂层珠激活的B细胞中中活性素的定量。行为素池用箭头指示。中位相关组件的量化（如本例中的 actin）可以由点图表示，其中每个点表示一个单元格。
激活后，B细胞在中体周围的行为素量减少。这一步骤很重要，将中圆体从核区域分离，以允许其极化到新的突触。对于在抗原涂层表面激活的 B 细胞，您可以研究行为素重塑以及细胞器在突触膜的招募。
在这里，我们展示了对细胞器的分析，如高尔吉装置和内质神经，分别显示中央和外围分布。此外，我们可以计算不同激活时间点后B细胞的扩散面积。为此，我们标记 actin 以能够在 XY 平面中定义单元格限制。
在图中，您可以观察激活 30 分钟和 60 分钟后单元格区域的增加。细胞器的分布也可以在XZ平面中计算，分别与突触界面。该图表示 z 平面中行为素的分布，其中前两个平面对应于突触界面。
我们可以观察到，行为素在激活后在这个领域变得丰富。除了成像分析外，生化方法还可用于研究B细胞活化时中糖体组成的变化。我们在这里展示一个具有代表性的西方包含半体的分数的印迹，由米色矩形突出显示。
在不连续的蔗糖梯度上分离出半点分数，并通过伽马-图布林水平检测。下面的西方印迹显示作用素和 Arp2 在休息的 B 细胞的中分中，这些细胞在激活时会耗尽。B淋巴细胞在膜界面上发生动态变化，形成功能性免疫突触。
这个过程可以通过本视频中描述的成像和生化技术来研究。我们相信，这种分析可以提供有关B细胞如何被有效激活的分子机制的价值信息。
