Bu videoda, popülasyonlar üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve bilimsel değeri en üst düzeye çıkarmak amacıyla yarasaları insancıl bir şekilde toplamak için adım adım kılavuz salıyoruz. Yaklaşımımızın avantajları, her yarasa için potansiyel moleküler ve morfolojik veri miktarını en üst düzeye çıkarmak, gelecekteki değerlerini korumak için dokuları korumak ve yabani bireylerin hasat en aza indirmek tir. Diseksiyon protokollerini sözlü olarak göstermek zordur.
Burada sunduğumuz doku hazırlama tekniklerinin çoğu, farklı organların nasıl tanımlandığını görselleştirerek en iyi şekilde iletilir ve daha sonra düzgün bir şekilde incelenir ve depolanır. Gecikmeleri önlemek için herhangi bir diseksiyon başlamadan önce tüm şişeleri hazırlayın. RNA için, her numune için gerekli şişe sayısını bir kenara koyun.
Her tüpü, toplanacak doku tipive standart numune tanımlama bilgilerini etiketle. Şişeleri %50 dolu RNA stabilizatör çözeltisi doldurun ve dört dereceye kadar soğutun. Tüp sıvı nitrojene yerleştirirken patlayabilir gibi, şişeleri RNA stabilizatör çözeltisi ile tamamen doldurmamaya dikkat edin.
Ötenaziden hemen sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi yarasa örneğinin kafasının kesilmesini gerçekleştirin. Deri saç kafatası, fasya, ve kafatası kasları, burun deri de dahil olmak üzere. Burnun ön ucunu kırmamaya dikkat edin.
Optik sinir ayırmak için yeterince güçlü güç kullanarak, forceps ile gözleri çıkarın. Gözleri iki mililitrelik rna stabilizatör çözeltisi içine yerleştirin. Boyundan başlayarak kafatasının dorsal kısmında sagital bir kesik yapmak için makas kullanın, beyne zarar vermemeye özen.
Daha sonra, kafatasının her iki tarafını da nazikçe geri çekmek için forseps kullanın, ta ki beyni ortaya çıkarmak için çatlayana kadar. Kafatasının kafatasının çıkarıldığından emin olun, böylece forcep'ler beyni kolayca kazıyabilir. Beyni ponplarla hafifçe kazıyın.
Beyin çok yumuşak olacak. Koku ampul görünür hale gelecektir, kafatasıiç ventral kısmında oturan. Koku ampulü bağlı tutmaya çalışın.
Mümkünse, beyin şeklini sağlam tutun ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin, ya da RNA stabilize çözeltisi beş mililitrelik şişe. Kafatasının kaudal ucunda, koklei şimdi yanal başın her iki tarafında görünür olmalıdır. Kokleiyi yavaşça çekmek için forceps kullanın.
Sonra, rna stabilize çözeltisi bir iki mililitrelik şişe onları koyun. Üst ve alt çenenin birleştiği yerde iki kesi yapın ve çeneyi çıkarın. Kribriform plaka belirgin hale gelecektir.
Bu araştırmacı odaklı tutmak için kritik bir kemiktir. Kafatasının en ön bölgesi olarak tanımlanabilir, birden fazla foramen ile, ve koku ampul dinlenir iki oluklar ile. Mandibula çıkarıldıktan sonra, kafatasının kalan kısmından rostrum çıkarın.
Çenenin kribriform plakayı içerdiğinden emin olun. Burnu RNA stabilizatör çözeltiye yerleştirin ve bir gecede dört derece santigrat derecede saklayın. Alt mandibula itibaren, makas ile dil kesti, ve RNA stabilize çözeltisi iki mililitrelik şişe yerleştirin.
Burun şişesini rna stabilizatör çözeltisinde bir gece bekletmeden sonra sıvı nitrojene yerleştirin. Buz üzerinde veya buzdolabında ıslatma 24 saat sonra, sıvı nitrojen örnekleri yerleştirin. Karın boşluğu ile delmek için bir neşter kullanın, kaburga kadar uzunlamasına bir kesi yapma.
Bu iskelet çerçevesini kaybeder. Pektoral kas ortaya çıkarmak için cilt şerit, ve kas en az iki örnek almak. Bu diseksiyonlar sırasında hem RNA hem de DNA dokuları toplanır.
Kuru cryovials içine yüksek molekül ağırlıklı DNA için dokular yerleştirin ve sıvı nitrojen flaş dondurma. RNA stabilizatör çözeltisindeki RNA için dokuları yerleştirin. Göğüs kafesini kes ve kaburgaları çek.
Şimdi, akciğeri ve kalbi geri al. Kalbi akciğerden ayırmak için neşter ve terpsesi kullanın. Akciğer kırmak için bir neşter kullanın, ve RNA stabilize çözeltisi yerleştirin.
Tüm alınabilir kalp toplamak, ancak yarıya kesilmelidir, böylece RNA stabilize çözeltisi iyice ıslatır. Şimdi, karaciğerden örnek al. En az iki karaciğer örneği alın.
Yüksek molekül ağırlıklı DNA için donmuş kalması için bir numuneyi bir şişeye yerleştirin ve diğer örneği RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirin. Pankreas ve safra kesesi bulmak için hepatik kanalı izleyin. Safra kesesini bir şişe RNA stabilizatör çözeltisine aktarın.
Mideyi ve tabanındaki tüy benzeri dalağını bulun, morun farklı bir tonu gibi görünün. Pankreas da burada bir ağırlık yapısı olarak görünür olmalıdır. RNA stabilize çözeltisi ilgili şişelerde mide, dalak ve pankreas toplamak.
Küçük ve kalın bağırsak küçük örnekleri toplamak. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin. Böbreklerden birini alın ve kanallarını mesaneye kadar takip edin, sonra rna stabilizasyon çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.
Eğer erkek, ya da rahim ve yumurtalıklar eğer kadın testisleri bulmak için bir rehber olarak diğer böbrek kullanın. Mümkünse bir veya her iki gonad toplayın. Ayrıca, kanat derisinin çeşitli bölgelerinden örnekler almak ve ayrı şişelerde tutmak.
Yaklaşımımızın en büyük avantajı, hayvanları öldürücü olmayan bir şekilde örneklememize olanak sağlarken, genomik çalışmalar ve fonksiyonel moleküler çalışmalar için yeterli malzeme üretmemizdir. Protokolümüz kanat dokusundan primer fibroblastların hazırlanmasına olanak sağlar. Hücreler değerli bir yenilenebilir genetik malzeme kaynağını ve yarasalarda fonksiyonel ve moleküler keşifler için bir model temsil eder.
Yazılı protokolün altıncı bölümü ne göre büyüme medyasında korunmuş kanat klipleri doku kültür tesisine aktarılmalıdır. Tüpün içeriğini 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Bu gösteriiçin kanat zarı biyopsisi kullanılır.
Büyüme ortamını dikkatlice çıkarın. Biyopsiyi 500 mikrolitre steril PBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Tüpe mililitre kollajenaz başına bir miligram 500 mikrolitre ekleyin.
Bu tek tek hücrelere doku sindirimine neden olacaktır. Bir gecede 37 derecede ajitasyon olmadan kuluçkaya yat. İkinci gün, yeni bir büyüme ortamı yaratın ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.
Kullanılacak plakanın her kuyunun her bir kuyunun ait taze önceden ısıtılmış büyüme ortamına iki mililitre ekleyerek altı kuyulu doku kültür plakası hazırlayın. Bu plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit kuvözde ihtiyaç duyulana kadar saklayın. Hücreleri içeren 15 mililitrelik tüpü kuvözden çıkarın ve bir mililitre taze büyüme ortamı ekleyerek sindirim reaksiyonu söndürün.
Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için p1000 pipet ucu ile çözeltiyi dikkatlice triturating ederek hücreleri yeniden askıya alın. P1000 pipetli sıvının %80 ila %90'ını hafifçe çıkararak 300 kez G.At'ta üç dakika boyunca bir masa üstü santrifüjdeki hücreleri yavaşça aşağı doğru çevirin. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 500 mikrolitreiçinde pelet resuspend.
Peletin artık görünür olmadığından ve hücrelerin yeterince askıya alınmasını sağlamak için süspansiyonu hafifçe triturate, duvarlarda hala görülebilecek küçük doku parçalarından kaçınmayı unutmayın. Daha önce hazırlanan altı kuyu plakasının tek bir kuyusu içine hücre süspansiyonunun tüm hacmini hafifçe pipetlendirin, önceden ısınma ortamını içerir. Hücreleri tek bir tabaka halinde kuyu yüzeyi üzerinde dağıtmak yardımcı olmak için yavaşça yan yana ve önden arkaya 2-3 kez plaka sallayın.
Mikroskop altında kaplanmış hücreleri kontrol edin. Onlar toplanmış ve yüzen görünen tek hücreler olmalı, ama çok yoğun. Plakayı dikkatlice 37 santigrat derece ve %5 karbondioksite önceden ayarlanmış bir kuvöze yerleştirin.
Yaklaşık 24 saat sonra, kültürün sağlığını belirlemek için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Hücreler artık plaka yüzeyine iliştirilmeli ve düzleştirilmiş görünmelidir. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit önceden ayarlanmış bir nemlendirilmiş kuluçka hücreleri koruyun.
Hücreler düzenli olarak medya ferahlık veya bölme ihtiyacını belirlemek için mikroskop altında gözlenmelidir. Gerektiğinde, dikkatlice kuyudan orta yaklaşık% 50 aspire, ve yavaşça kuyunun tarafına önceden ısıtılmış büyüme ortamı bir mililitre ekleyin, böylece hücreleri rahatsız değil. Hücrelerin geçişi gerektiğinde, büyüme ortamının yaklaşık %90'ını dikkatlice aspire edin.
Hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun duvarına bir mililitre steril PBS ekleyerek hücreleri çok nazikçe yıkayın. Yavaşça ileri ve geri ve yan yan 2-3 kez plaka kaya. Hücreleri tekrar yıkamadan önce tüm PBS'yi plakadan dikkatlice aspire edin.
Kuyuya tripsin EDTA ekleyin ve incelikle detektifi yüzeyini trypsin EDTA ile kaplayacak şekilde kayalayın ve oda sıcaklığında bir buçuk dakika kuluçkaya yatırın. Taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı bir mililitre ekleyerek reaksiyon söndürmek. Pipet yukarı ve aşağı yaklaşık beş kez plaka yüzeyinden hücreleri yıkamak ve hücrelerin süspansiyon olduğundan emin olun.
Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve hücreleri 300 kez g.Atla ve p1000 pipetli sıvının yüzde 80 ila 90'ını hafifçe çıkararak üç dakika boyunca bir masa üstü santrifüjünde döndürün. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının bir mililitreiçinde pelet resuspend, ve yavaşça süspansiyon triturate. Peletveya peletin büyük parçalarının artık görünmediğinden ve hücrelerin tek hücreli süspansiyonda olduğundan emin olun.
Hücreyi otomatik bir hücre sayacı kullanarak saymak için, asılı hücrelerin on mikrolitrelik aliquot'unu bire bir trypan mavisi ile karıştırarak canlı hücreleri tespit edin. Bir dakika kuluçka ve pipet 10 mikrolitre çözeltiyi sayma slaytına. Uygun ayarları kullanarak hücreleri saymak için sayım slaytını otomatik bir hücre sayacına ekleyin.
%10 DMSO'luk son konsantrasyonu elde etmek için büyüme ortamını DMSO ile birleştirerek dondurucu ortam hazırlayın. Pelet bir 80 ila% 90 bir altı kuyu plaka sıyrık iyi hazırlanmalıdır. Bir buçuk mililitre dondurucu ortamda peleti yeniden askıya alın.
İki ayrı cryovial'ın her birine yaklaşık 750 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin. Hücreleri hücre canlılığını korumak için yavaş yavaş donma böylece bir kriyojenik donma kabına şişeleri yerleştirin. Hemen eksi 80 santigrat derece yerleştirin.
Dondurulmuş hücreleri eritmek için, kullanılacak her kuyuda önceden ısıtılmış büyüme ortamı iki mililitre içeren altı kuyu plaka sıhazırlayın. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit inkübatöründe ihtiyaç duyulana kadar saklayın. Sıvı nitrojen den hücrelerin bir şişe alın ve hızla hücreleri eritmek için Sıcak bir su banyosu yerleştirin.
Bu 2-3 dakika sürer. Şişedeki çözelti çözülür çözülmez, çözeltiyi homojenize etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet alın ve hemen tüm çözeltiyi altı kuyunun bir kuyuya yerleştirin. Hücreleri tek bir tabaka halinde kuyu yüzeyi üzerinde dağıtmak yardımcı olmak için yavaşça yan yana ve önden arkaya 2-3 kez plaka sallayın.
Hücreleri 37 derecede kuvöze yerleştirin ve %5 karbondioksiti 24 ila 48 saat boyunca. Gösterildiği gibi hücreleri izleyin ve iletin. DNA ekstraksiyonlarının temsili sonuçları üç yarasa türünün standart DNA analizleri için gösterilmiştir.
Tek bir büyük bant en az parçalanma ve her ilgili çıkarma DNA benzer büyüklükte parçaları gösterir. RNA ekstraksiyonları için başarının ortak bir göstergesi, tact RNA'da yüksek kaliteyi temsil eden sekizin üzerindeki değerlere sahip RNA bütünlük numarası veya RIN'dir. Burada gösterilen neotropikal yarasa türlerinin 13 farklı doku türünden RNA ekstraksiyonrisi, dört farklı yerde örneklenmiştir.
Andes, Kosta Rika ve Dominik Cumhuriyeti'ndeki türlerden alınan dokular, bir gecede dört derece santigrat derecede RNA stabilizasyon çözeltisinde ıslatıldıktan sonra doğrudan sıvı nitrojene yerleştirildi. Amazon'daki türlerden alınan dokular, RNA stabilizatör çözeltisi yerleştirildikten yaklaşık bir hafta sonra sıvı nitrojene yerleştirildi ve sürekli olarak dört derece santigrat derecede tutuldu. Bu gibi durumlarda bile RIN değerleri hemen RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirilenlerle ve doğrudan sıvı nitrojene karşılaştırılabilirdi.
Doku kültürünü takiben, yarasa hücre kültürleri plaka yüzeyinin %80-90'ını kapsamalı ve orijinal morfolojilerini sürdürmelidir. Bu, bölme için en uygun aşamayı temsil eder. Altıdan fazla pasajdan sonra, hücreler morfolojilerini değiştirerek daha büyük ve daha uzun hale gelecekler ve hücreler senescence'a girecekler.
Parlak toplanmış hücreler ölü hücreleri temsil eder. Kültürdeki hücreler DNA, RNA ve protein gibi yenilenebilir bir malzeme kaynağını temsil eder. Bu hücre hatları dondurulabilir, böylece araştırma uzun yıllar boyunca kullanılabilecek bir kaynak sağlayan.
Bu, birincil dokular kullanılarak zor olacak genomik, transkripsiyonel ve fonksiyonel çalışmalar sağlar. Örneğin, hücreler hücresel fenotipler üzerindeki etkilerini gözlemlemek için genetik veya kimyasal olarak değiştirilebilir.
