En este video, proporcionamos una guía paso a paso para recolectar murciélagos de una manera humana, destinada a minimizar el impacto en las poblaciones y maximizar el valor científico. Las ventajas de nuestro enfoque son que maximizamos la cantidad de datos moleculares y morfológicos potenciales para cada murciélago, preservamos los tejidos para conservar su valor futuro y minimizamos la recolección de individuos silvestres. Los protocolos de disección son difíciles de demostrar verbalmente.
Muchas de las técnicas de preparación de tejidos que presentamos aquí se comunican mejor a través de la visualización de cómo se identifican los diferentes órganos, y luego se diseccionan y almacenan adecuadamente. Prepare todos los viales antes de iniciar cualquier disecta para evitar retrasos. Para el ARN, reserve el número de viales necesarios para cada muestra.
Etiquete cada tubo con el tipo de tejido que se recogerá, así como información de identificación de muestras estándar. Llenar los viales 50% llenos de solución estabilizadora de ARN, y enfriar a cuatro grados centígrados. Tenga cuidado de no llenar los viales completamente con solución estabilizadora de ARN, ya que el tubo puede explotar al colocarlo en nitrógeno líquido.
Inmediatamente después de la eutanasia, realice la decapitación del espécimen del murciélago como se describe en el protocolo de texto. Piel del cráneo del cabello, fascia, y los músculos del cráneo, incluyendo la piel en la nariz. Tenga cuidado de no romper la parte delantera de la nariz.
Retire los ojos con fórceps, utilizando la fuerza lo suficientemente fuerte como para separar el nervio óptico. Coloque los ojos en un vial de dos mililitros de solución estabilizadora de ARN. Use tijeras para hacer un corte sagital en la parte dorsal del cráneo comenzando en el cuello, teniendo cuidado de no dañar el cerebro.
Luego, usa fórceps para tirar suavemente hacia atrás ambos lados del cráneo, hasta que se abra para exponer el cerebro. Asegúrese de que el cráneo del extremo craneal ha sido eliminado, de modo que los fórceps puedan raspar fácilmente el cerebro. Raspa suavemente el cerebro con fórceps.
El cerebro será muy suave. El bulbo olfativo se hará visible, sentado en la parte ventral del interior del cráneo. Trate de mantener la bombilla olfativa unida.
Si es posible, mantenga intacta la forma del cerebro e inmediatamente colóquela sobre hielo seco, o en un vial de cinco mililitros de solución estabilizadora de ARN. En el extremo caudal del cráneo, el cochlei ahora debe ser visible lateralmente a cada lado de la cabeza. Use fórceps para tirar suavemente de los cochlei.
A continuación, colóquelos en un vial de dos mililitros de solución estabilizadora de ARN. Haga dos incisiones donde la mandíbula superior e inferior se unan, y retire la mandíbula. La placa cribriforme se hará evidente.
Este es un hueso crítico para mantener al investigador orientado. Se puede identificar como la región más anterior del cráneo, con múltiples foramen, y con dos ranuras donde descansa el bulbo olfativo. Una vez que la mandíbula ha sido removida, retire la tribuna de la parte restante del cráneo.
Asegúrese de que la mandíbula incluya la placa cribriform. Coloque la nariz en la solución estabilizadora del ARN y guárdelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Desde la mandíbula inferior, cortar la lengua con tijeras, y colocar en un vial de dos mililitros de solución estabilizadora de ARN.
Coloque el vial de nariz en nitrógeno líquido después del remojo durante la noche en solución estabilizadora de ARN. Después de 24 horas de remojo en hielo, o en la nevera, coloque las muestras en nitrógeno líquido. Usa un bisturí para perforar a través de la cavidad abdominal, haciendo una incisión longitudinal hasta las costillas.
Esto pierde el marco esquelético. Despojar la piel para revelar el músculo pectoral, y tomar al menos dos muestras de músculo. Los tejidos tanto para el ARN como para el ADN se recogen durante estas disecciones.
Coloque los tejidos para ADN de alto peso molecular en criotismos secos y congelar el flash en nitrógeno líquido. Coloque los tejidos para el ARN en la solución estabilizadora del ARN. Corta el esternón y retira las costillas.
Ahora, recupera el pulmón y el corazón. Usa el bisturí y los fórceps para separar el corazón del pulmón. Use un bisturí para romper el pulmón y colóquelo en la solución estabilizadora del ARN.
Recoger el corazón, que se puede tomar entero, pero debe ser seccionado en mitades, de modo que la solución estabilizadora de ARN se empape a fondo. Ahora, toma muestras del hígado. Tome al menos dos muestras de hígado.
Coloque una muestra en un vial para permanecer congelada para ADN de alto peso molecular y coloque la otra muestra en solución estabilizadora de ARN. Siga el conducto hepático para encontrar el páncreas y la vesícula biliar. Transfiera la vesícula biliar a un vial de solución estabilizadora de ARN.
Encuentra el estómago, y el bazo en forma de pluma en su base, apareciendo como un tono diferente de púrpura. El páncreas también debe ser visible aquí como una estructura de peso. Recoger el estómago, el bazo y el páncreas, en los viales respectivos de la solución estabilizadora del ARN.
Recoger pequeñas muestras del intestino delgado y grueso. Colocar en los viales respectivos de solución estabilizadora de ARN. Tome uno de los riñones y siga sus conductos hasta la vejiga, luego colóquelos en los viales respectivos de la solución estabilizadora del ARN.
Utilice el otro riñón como guía para encontrar los testículos si son masculinos, o el útero y los ovarios si son femeninos. Recoge una o ambas gónadas si es posible. También tome muestras de varias partes de la piel del ala, y guárdalas en viales separados.
La principal ventaja de nuestro enfoque es que nos permite tomar muestras de animales de una manera no letal, sin dejar de generar suficiente material para estudios genómicos, así como estudios moleculares funcionales. Nuestro protocolo permite la preparación de fibroblastos primarios a partir de tejido de ala. Las células representan una valiosa fuente renovable de material genético, así como un modelo para exploraciones funcionales y moleculares en murciélagos.
Los clips de ala que se hayan conservado en medios de crecimiento según la sección seis del protocolo escrito deben transferirse a la instalación de cultivo de tejidos. Transfiera el contenido del tubo a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros. La biopsia de membrana de ala se utiliza para esta demostración.
Retire con cuidado el medio de crecimiento. Lave suavemente la biopsia dos veces con 500 microlitros de PBS estéril. Añadir 500 microlitros de un miligramo por mililitro de colagenasa cuatro al tubo.
Esto causará la digestión del tejido en células individuales. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados sin agitación. En el segundo día, haz un nuevo medio de crecimiento, y precalima a 37 grados centígrados.
Preparar una placa de cultivo de tejido de seis bien mediante la adición de dos mililitros de medio de crecimiento precalentado fresco en cada pozo de la placa a utilizar. Almacene esta placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados centígrados y 5% hasta que sea necesario. Retire el tubo de 15 mililitros que contiene las células de la incubadora, y sostente la reacción de digestión añadiendo un mililitro de medio de crecimiento fresco.
Resuspender las células mediante la trituración cuidadosa de la solución con una punta de pipeta P1000 para lograr una suspensión de una sola célula. Gire suavemente las células en una centrífuga de mesa durante tres minutos a 300 veces G.Deseche el sobrenadante retirando suavemente del 80 al 90% del líquido con una pipeta P1000. Resuspender el pellet en 500 microlitros de medio de crecimiento precalificado.
Triturar suavemente la suspensión para asegurarse de que el pellet ya no es visible, y que las células están suficientemente suspendidas, asegurándose de evitar pequeños trozos de tejido que todavía pueden ser visibles en las paredes. Pipetear suavemente todo el volumen de la suspensión celular en un solo pozo de la placa de seis pozos que se preparó anteriormente, que contiene los medios de crecimiento precalentamiento. Mece suavemente la placa de lado a lado y de adelante hacia atrás de dos a tres veces para ayudar a las células a distribuirse sobre la superficie del pozo en una sola capa.
Revise las células chapadas bajo un microscopio. Deben ser células individuales que aparecen en la bola hacia arriba y flotando, pero muy densas. Coloque cuidadosamente la placa en una incubadora preestablecida a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Después de aproximadamente 24 horas, observe las células bajo el microscopio para determinar la salud del cultivo. Las celdas ahora deben estar unidas a la superficie de la placa y aplanarse. Mantenga las células en una incubadora humidificada preestablecida a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Las células deben observarse bajo el microscopio regularmente para determinar la necesidad de refresco o división de medios. Siempre que sea necesario, aspirar cuidadosamente aproximadamente el 50% del medio del pozo, y añadir suavemente un mililitro de medio de crecimiento precalentado al lado del pozo, para no perturbar las células. Cuando sea necesario pasar las células, aspirar cuidadosamente aproximadamente el 90% del medio de crecimiento.
Lavar las células muy suavemente añadiendo un mililitro de PBS estéril a la pared del pozo, para no molestar a las células. Mece suavemente la placa de ida y vuelta y de lado a lado dos o tres veces. Aspirar cuidadosamente todo el PBS de la placa antes de lavar las células de nuevo.
Añadir trypsin EDTA al pozo, y balancear suavemente la placa para cubrir toda la superficie del pozo con trypsin EDTA, e incubar durante un minuto y medio a temperatura ambiente. Apague la reacción añadiendo un mililitro de medio de crecimiento precalentado fresco. Pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces para lavar las células de la superficie de la placa, y asegurarse de que las células están en suspensión.
Coloque la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y gire hacia abajo las células en una centrífuga de mesa durante tres minutos a 300 veces G.Deseche el sobrenadante retirando suavemente del 80 al 90 por ciento del líquido con una pipeta P1000. Resuspender el pellet en un mililitro de medio de crecimiento precalentado, y triturar suavemente la suspensión. Asegúrese de que el pellet o fragmentos grandes del pellet ya no son visibles, y las células están en una sola suspensión celular.
Para contar la célula usando un contador de células automatizado, mezcle una alícuota de diez microlitliter de las células suspendidas de una a una con el azul de tripano para detectar células viables. Incubar durante un minuto, y pipetear 10 microlitros de la solución en el tobogán de conteo. Inserte la diapositiva de recuento en un contador de celdas automatizado para contar las celdas utilizando la configuración adecuada.
Preparar medios de congelación combinando el medio de crecimiento con DMSO para obtener una concentración final de 10%DMSO. El pellet debe prepararse a partir de un pozo de 80 a 90% confluente de una placa de seis pozos. Resuspender el pellet en un mililitro y medio de medio de congelación.
Coloque aproximadamente 750 microlitros de suspensión celular en cada uno de los dos crioviales separados. Coloque los viales en un recipiente de congelación criogénica, de modo que las células se congelen lentamente para mantener la vitalidad celular. Colóquelos inmediatamente a menos 80 grados centígrados.
Para descongelar las células congeladas, prepare una placa de seis pozos que contenga dos mililitros de medio de crecimiento precalentado en cada pozo que se utilizará. Mantener la placa en la incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que sea necesario. Tome un vial de células de nitrógeno líquido y colóquelo en un baño de agua tibia para descongelar rápidamente las células.
Esto tardara de dos a tres minutos. Tan pronto como la solución en el vial se haya descongelado, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución, y coloque inmediatamente toda la solución en un pozo de la placa de seis pozos. Mece suavemente la placa de lado a lado y de adelante hacia atrás de dos a tres veces para ayudar a las células a distribuirse sobre la superficie del pozo en una sola capa.
Coloque las células en la incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Supervise y pasaje las células como se ha demostrado. Los resultados representativos de las extracciones de ADN se muestran para los análisis estándar de ADN de tres especies de murciélagos.
Una sola banda grande indica una fragmentación mínima y fragmentos de ADN de tamaño similar de cada extracción respectiva. Un indicador común de éxito para las extracciones de ARN es el número de integridad del ARN, o RIN, con valores por encima de ocho que representan la alta calidad en el ARN tacto. Aquí se muestran los valores RIN de las extracciones de ARN de 13 tipos de tejidos diferentes de especies de murciélagos neotropicales, muestreados en cuatro localidades diferentes.
Los tejidos muestreados de especies de los Andes, Costa Rica y la República Dominicana se colocaron directamente en nitrógeno líquido después de remojar en solución estabilizadora de ARN a cuatro grados centígrados durante la noche. Los tejidos muestreados a partir de especies en el Amazonas se colocaron en nitrógeno líquido aproximadamente una semana después de colocar una solución estabilizadora de ARN, y se mantuvieron en cuatro grados centígrados continuamente. Incluso en tales casos, los valores de RIN fueron comparables a los colocados inmediatamente en la solución estabilizadora de ARN, y directamente en nitrógeno líquido.
Después del cultivo del tejido, los cultivos de células de murciélago deben cubrir entre el 80 y el 90% de la superficie de la placa, y mantener su morfología original. Esto representa la etapa óptima para la división. Después de más de seis pasajes, las células cambiarán su morfología para que se vuelvan más grandes y más largas, y las células entrarán en senescencia.
Las células brillantes de bola hacia arriba representan células muertas. Las células en el cultivo representan una fuente renovable de material, como EL ADN, el ARN y la proteína. Estas líneas celulares se pueden congelar, proporcionando así un recurso que se puede utilizar a lo largo de muchos años de investigación.
Esto permite estudios genómicos, transcriptómicos y funcionales que serán difíciles de usar los tejidos primarios. Por ejemplo, las células se pueden modificar genética o químicamente para observar efectos sobre los fenotipos celulares.
