Birincil rapor, sinaps sayılarının değiştiği ve fonksiyonun analiz edilebildiği çoğu modelde baziler membranın spesifik frekans bölgesini doğru bir şekilde bulmanın önemidir. Belirli frekans bölgelerinin koklear yerelleştirme s›kleogram verileri ile birlikte frekans haritalar› kullanılarak güvenilir bir şekilde gerçekleştirilir. Mikroskop çeşitli araştırma çalışmaları içine fikir sağlar.
Koklear nöropatinin özellikle işitme kaybı, kulak çınlaması ve hiperacusis'ten önceki birincil ilk olaylar olduğu fikrini destekler. Anestezi sekiz haftalık yetişkin C57 siyah 6J erkek fare de parmak çimdik yanıt eksikliği doğruladıktan sonra. Fareyi elektriksel ve akustik korumalı bir odada 37 derece lik bir ısı yastığına yerleştirin.
Sonra, kafatasının tepe noktasında deri altında üç milimetre derinliği ile bir subdermal 20 milimetre 28 gauge iğne kayıt elektrot yerleştirin. Ipsilateral parotis bölgesinde, ölçülen kulak pinnasının altında bir referans elektrot ve kontralateral parotis bölgesinde bir zemin elektrot. Farenin yanına koni şeklinde bir ucu olan iki santimetrelik plastik bir tüple donatılmış kapalı bir alan hoparlörü yerleştirin ve ucu dış kulak kanalına sığdırın.
İşitsel beyin sapı yanıtı veya ABR kaydı için, ses basıncı düzeylerini 5 ila 10 desibel ses basıncı düzeyinde ki adımlarda 90 ila 10 desibel arasında düşürerek ton boruları oluşturur. Bu adımda, yanıtlar yükseltilir, filtrelenir ve ortalamaya alınır. Her frekansta, görsel denetimle net bir şekilde tanımlanabilen bir veya daha fazla ayırt edilebilir dalgayla güvenilir bir ABR kaydıyla sonuçlanan en az ses basıncı düzeyi olan ABR eşiğini belirleyin.
ABR kaydından sonra, ventral taraftan bulla ortaya ve koklea erişmek için keskin makas ile bulla açın. İnce kasiler kullanarak, temporal kemikleri çıkarın ve stapes arter ilerler. Sonra oval pencereden stapes çıkarın ve yuvarlak pencere membran yırtMak.
13 milimetrelik 27 gauge iğnenin ucunu yavaşça döndürerek kokleanın tepesinde küçük bir delik açın, ince uçlu pipet kullanarak %4 paraformaldehiti pencereden perilenfatik alanlara doğru hafifçe temizler. Daha sonra, yıkama başına soğuk taze 0,1 molar PBS ile yıkama başına beş dakika boyunca kemikleri üç kez durulayın. Oda sıcaklığında dört saat boyunca %10 EDTA ile kemiklerin kireçlenmesi ve yatay bir çalkalayıcıda dakikada 20 dönüş ile izlenir.
Kuluçka sonunda, bir diseksiyon mikroskop altında taze 0.1 molar PBS içine kireçlenmiş bir temporal kemik aktarın. Sırayla apikal, orta ve bazal koklea bölgelerini incelemek için 3 ve 5 Dumont forsepsve 27 gauge iğne kullanın. Spiral ligament boyunca kesikler küçük bir dizi yapmak ve tektorial membran ve Reissner membran kaldırmak için bir jilet kullanın.
Spiral limbus da dahil olmak üzere kalan işitsel epiteli, tüm montaj hazırlıkları için ayrı ayrı koklear dönüşlere dönüştürün. Daha sonra göz parçasına yerleştirilen 250 mikrometre lik ölçekle baziler membran uzunluğunu ölçmek için ışık mikroskobunun 40X yağ amacını kullanın. Bu iç saç hücrelerinin stereocilia boyunca ayarlanabilir.
Diseksiyon sonra, ayrı 2.5 mililitre santrifüj tüpler içine her koklear dönüş yerleştirin. PBS'de %10 keçi serumu ile nonspesifik bağlanmayı %0,1 Triton X-100'de bir rotatörde oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin. Kuluçka sonunda, bir diseksiyon mikroskobu altında çözeltikaldırmak için 200 mikrolitre pipet ucu kullanın.
%5 keçi serumu ve PBS'de %0.1 Triton X-100 ile %0.1 triton X-100'de seyreltilmiş birincil antikorlarla numuneleri bir rotatörde 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, herhangi bir kalıntı primer antikor kaldırmak için yıkama başına soğuk 0.1 molar PBS ile beş dakika boyunca doku örneklerini üç kez durulayın. Daha sonra numuneleri PBS'de %5 keçi serumunda seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla %0,1 Triton X-100'de, ışıktan korunan rotatörde oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle etiketlendi.
Kuluçka sonunda, numuneleri gösterildiği gibi 0,1 molar PBS ile üç kez yıkayın ve numuneleri 0,1 molar PBS içeren tek tek 35 milimetrelik plakalara aktarın. Slaytüzerine DAPI takviyeli montaj ortamı bir damla yerleştirin ve pbs gelen montaj ortamına örnekleri aktarın. Her slayt üzerine bir kapak kayma bir kenar yerleştirin ve kapak kaymaları yavaşça düşmesini sağlamak için bırakın.
Daha sonra slaytları bir gecede dört derece santigrat derecede bir slayt kutusunda kurulayın. Numuneleri görüntülemek için, her koklear dönüşten sekiz mikrometre konfokal Z destesi elde etmek için uygun lazerler ve 63X yüksek çözünürlüklü yağ daldırma lensi ile bir konfokal mikroskop kullanın. Sinaptik puncta sayıları için, 0,3 mikrometre adım boyutuna sahip Z yığınlarını iç saç hücrelerinin tüm uzunluğunu kapacak şekilde ayarlayın, sinaptik puncta'nın tamamının görüntülenebileceğini ve Z erişim projeksiyonuna ulaşmak için Z destesinde görüntüleri içeren puncta'yı birleştirebileceğini sigortalayın.
Birleştirilmiş görüntüleri uygun bir görüntü işleme yazılımı programına aktarın. Her hücre için sinaptik puncta sayısını hesaplamak için DAPI pozitif iç saç hücrelerinin sayısına göre belirli frekans bölgelerinde her Z yığınında sinaptik toplam sayıları bölün. Her belirli frekans bölgesinde, dokuz ila 11 iç saç hücresi içeren farklı mikroskobik alanların üç görüntüsünün tüm sinaptik puncta ortalama.
Sitoskelet mimarisini ve sinaptik lokalizasyonu daha iyi görselleştirmek için, fırça aracını kullanarak sinaptik yapıyı ve bireysel iç saç hücrelerinin dağılımını görsel olarak değerlendirin. Presinaptik şeritler ve postsinaptik reseptör yamaları yan yana incelemek için, dikdörtgen marquee aracı şeritler etrafında voxel alanı ayıklamak ve tek tek şeritler izole etmek için görüntü kesme kullanın. Ardından, eşleştirilmiş sinapsları ve yetim şeritleri tanımlamak için kullanılabilecek bu minyatür projeksiyonların küçük resim dizisini elde etmek için resim ve resim boyutunu tıklatın.
Bu temsili deneydeki farelerin on faresinin tümü, uyarıcının frekansına bağlı olarak ses basıncı seviyesi başına 25 ile 70 desibel arasında değişen ton patlamalarına yanıt olarak ABR eşikleri sergilemiştirilmiştir. Bu deneyin işitme eşiği koklear apeksten yaklaşık %43'e karşılık gelen 16 kilohertz'de en düşük seviyedeydi ve bu da akustik duyarlılığın diğer koklear bölgelerde önemli ölçüde azaldığını düşündürmektedir. İşitsel epitelin tüm bağları üç parçaya ayrılır ve uzunlukları ölçülür ve koklear apeksten yüzde lik mesafeye dönüştürülür.
Her koklear dönüşün baziler membranüzerindeki frekans konumu logaritmik fonksiyon kullanılarak hesaplanır. Erişkin farelerin normal kulaklarında, immünboyama sinaptik şeritler ve glutamat reseptör yamaları yan yana çiftleri ortaya koymaktadır. Hücre başına 8 ila 20 çift ile iç saç hücrelerinin bazolateral membran yüzeyi çalışma.
Puncta büyük çoğunluğu normal kulaklarda yan yana çiftleri olarak görünmesine rağmen, yetim kurdeleler seyrek yüksek büyütme ler gözlenir. İç saç hücre şerit sinaps sayısı 16 kilohertz bölgede en yüksek ve bu yerden mesafe arttıkça önemli ölçüde azalır. Bu işlem sırasında hatırlanması gereken en önemli şey koklear bazal membran bütünlüğünü garanti etmek gerektiğidir.
Teknik yeterliliğe ulaşılana kadar doğruluğu vurgulamalıyız. Bu prosedürü takiben, koklear nöropati bu önlem ile tamir edilebilir olup olmadığını cevaplamak için gen tedavisi yapılabilir. Bu ölçü koklear nöropati keşfetmek için daha geniş bir tekniktir, hangi birincil ilk olaylar işitme kaybı ile ilişkilendirmek eğer, tinnitus, ve hiperacusis.
