第一のレポートは、シナプス数が変化し、機能を分析することができるほとんどのモデルで、バジラー膜の特定の周波数領域を正確に見つけることの本当にストレスの重要性です。特定の周波数領域の人工内在化は、コクレオグラムデータと連動して周波数マップを配置して、確実に行われる。顕微鏡は、いくつかの研究研究への洞察を提供します。
人工内耳神経障害は、特に難聴、耳鳴り、および過敏症に先行する主要な初期事象であるという考えを支持する。麻酔付き8週齢の成人C57黒6Jオスマウスでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後。電気的に、音響的に遮蔽された部屋の37°Cのヒートパッドの上にマウスを置きます。
次に、皮下20ミリメートル28ゲージ針の記録電極を、頭蓋骨の頂点の皮膚の下に3ミリメートルの深さで置きます。イプシラショナル・パローシド領域における参照電極を、対側耳膜領域における測定された耳と接地電極の下に示す。マウスの横にコーン状の先端を持つ2センチメートルのプラスチックチューブを装備した閉じたフィールドスピーカーを配置し、外耳道にチップをフィットさせます。
聴覚脳幹応答、またはABR記録の場合、音圧レベルを90から10デシベルに減少させるトーンピップを5~10デシベルの音圧レベルステップで生成します。このステップでは、応答が増幅、フィルター処理、および平均化されます。各周波数で、ABRしきい値を決定し、視覚的な検査によって明確に識別できる1つ以上の識別可能な波を持つ信頼性の高いABR記録をもたらす最小の音圧レベルです。
ABRの記録の後、腹側からブラを露出し、鋭いはさみでブラを開いて、コクレアにアクセスします。細かい鉗子を使用して、側頭骨を取り除き、動脈のテープを切断する。その後、楕円形の窓からテープを取り出し、丸い窓膜を破裂させます。
13ミリメートル27ゲージ針の先端をそっと回転させて、内江の頂点に小さな穴を開け、細かいチップピペットを使用して窓から4%パラホルムアルデヒドをリンパ管腔に静かに洗い流します。次に、洗浄ごとに冷たい新鮮な0.1モルPBSで1回5分間骨を3回洗い流します。続いて、室温で4時間10%EDTA、水平シェーカーで毎分20回転の骨を脱灰する。
インキュベーションの終了時に、解剖顕微鏡下で、デカルシウム化された側頭骨を新鮮な0.1モルPBSに移します。3 と 5 デュモン鉗子と 27 ゲージの針を使用して、補助的な、中間の、そして基底の内耳の領域を順番に解剖します。カミソリの刃を使用して、スパイラル靭帯に沿って小さな一連の切り傷を行い、テクトリアル膜とレイスナーの膜を取り除きます。
さらに、スパイラルリムスを含む残りの聴覚上皮を、全体のマウント調製のために個々の人工内膜に解剖する。次に、光顕微鏡の40X油の目的を使用して、眼球に配置された250マイクロメートルスケールでバジラー膜の長さを測定します。これは、内側の毛細胞の立体に沿って調整することができます。
解剖後、各人工内毛を個々の2.5ミリリットル遠心管に入れます。0.1%トリトンX-100で10%ヤギ血清をローテーターの室温で1時間ブロックします。インキュベーションの終わりに、解剖顕微鏡の下で溶液を取り除くために200マイクロリットルピペット先端を使用する。
目的の一次抗体を含む試料を、5%ヤギ血清とPBSで0.1%トリトンX-100で一晩4度でローテーターでインキュベートします。翌朝、洗浄ごとに冷たい0.1モルPBSで組織サンプルを5分間3回洗い流し、残留一次抗体を除去します。次に、試料に適切な二次抗体をPBSで5%ヤギ血清に希釈し、0.1%トリトンX-100で、ローテーターの室温で2〜3時間、光から保護したラベルを付けます。
インキュベーションの終わりに、サンプルを0.1モルPBSで3回洗浄し、0.1モルPBSを含む個々の35ミリメートルプレートに試料を移します。DAPIを補った取り付け媒体をスライドに一滴置き、試料をPBSから取り付け媒体に移します。カバースリップの1つの端を各スライドに置き、カバースリップが穏やかに落ちるように解放します。
その後、スライドボックスのスライドを摂氏4度で一晩乾かします。標本を画像化するには、適切なレーザーと63X高解像度オイル浸漬レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、各人工内線ターンから8マイクロメータ共焦点Zスタックを取得します。シナプスパンクタ数の場合、0.3マイクロメートルのステップサイズを持つZスタックを内側のヘアセルの全長にまたがるように設定し、シナプスパンクタのすべてを画像化し、Zスタック内の画像を含むパンクタをマージしてZアクセス投影を取得します。
マージされたイメージを適切なイメージ処理ソフトウェア プログラムにインポートします。特定の周波数領域の各 Z スタックのシナプスの合計カウントを DAPI 正の内側のヘア セルの数で割り、各セルのシナプスパンクタの数を計算します。各特定の周波数領域で、9〜11の内側の毛細胞を含む異なる顕微鏡フィールドの3つの画像でシナプス穿刺のすべてを平均する。
細胞骨格アーキテクチャとシナプスの局在をより良く視覚化するには、ブラシツールを使用して、個々の内側の毛細胞のシナプス構造と分布を視覚的に評価します。シナプス前リボンと心内受容体パッチの並置を検査するには、長方形のマーキーツールを使用して、リボンの周りのボクセル空間を抽出し、画像切断を使用して個々のリボンを分離します。次に、[イメージとイメージサイズ] をクリックして、ペアのシナプスと孤立したリボンを識別するために使用できるこれらのミニチュア投影のサムネイル配列を取得します。
この代表的な実験のマウスの10匹は、刺激の頻度に応じて音圧レベルあたり25〜70デシベルのトーンバーストに応答してABR閾値を示した。この実験の聴力閾値は、人工内頂部からの距離の約43%に相当する16キロヘルツで最低であり、音響感度が他の人工内江領域で有意に低下することを示唆した。聴覚上皮の全体の台紙は3つの部分に分剖され、長さは測定され、人工内頂部からのパーセント距離に変換される。
各人工内膜ターンのバジル膜上の周波数位置は対数関数を用いて計算される。成体マウスの正常な耳では、免疫染色はシナプスリボンとグルタミン酸受容体パッチの並置ペアを明らかにする。細胞の内側のバソアテラ膜の表面を、細胞あたり8〜20組で研究する。
パンクタの大部分は正常な耳に並置されたペアとして見えますが、孤児のリボンは高倍率で観察される頻度は低くなります。内側のヘアセルリボンシナプスの数は、16キロヘルツ領域で最も多く、この場所からの距離が増加するにつれて大幅に減少します。この手順の間に覚えておかなければならない最も重要なことは、人工内膜の基礎膜の完全性を保証しなければならないということです。
技術的な熟練度に達するまで、正確性を強調する必要があります。この手順に従って、遺伝子治療は、この尺度によって人工内痛神経障害を修復できるかどうかに答えるために行うことができる。この尺度は、人工内耳神経障害を探索するためのより広い技術であり、主要な初期事象が難聴、耳鳴り、および過敏症を有することに関連する場合である。
