Asit maceration yöntemi böbrek hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir ve nasıl belirli genler katkıda bulunmak veya nefron gelişimini etkilemek yanı sıra nasıl belirli koşullar, diyabet veya hipertansiyon gibi, nefron sayısını etkiler. Fetal gelişim sırasında doğan bir bireyin toplam nefron sayısı belirlendiği ve nefron kaybının böbrek patolojisi ile ilişkili olduğu için bu önemlidir. Asit maceration yönteminin başlıca avantajları manyetik rezonans görüntüleme gibi diğer nefron sayma yöntemlerine göre daha hızlı, daha fazla tekrarlanabilir, ucuz ve daha az zaman alıcı olmasıdır.
Bu teknik, nefron sayısındaki etkinin böbrek fonksiyonu üzerindeki etkisini niçin daha iyi anlamamızı kolaylaştırıyor, bu da belirli genlerin nefron fonksiyonunu ve gelişimini nasıl etkilediğini daha iyi anlamamız için önemlidir. Genel nefron sayısını etkileyen genlerin veya faktörlerin incelenmesi, hastalıkla ilişkili nefron kaybını sınırlamak için tasarlanmış farmakolojik veya genetik yaklaşımların geliştirilmesinde etkili olacaktır. İyi deneysel teknik ve uygulama ile, bu yönteme yeni bireyler kolayca tüm böbrek nefron numaraları güvenilir ve tekrarlanabilir tahminler sağlayan asit maceration yöntemi ustalık kazanmalıdır.
Orta hat boyunca fare karın boşluğu açmak için ince cerrahi makas kullanarak başlayın. Dikkatle hayvanın sağ tarafına bağırsak ve üreme yağ kaydırın. Brüt diseksiyon kullanarak, sol böbrek izole ve dikkatle PBS uygun etiketli tartmak tekne içine organ yerleştirerek böbrek kaldırmak için sol böbrek arter ve damar kesti.
Aynı şekilde sağ böbrek toplamak ve pbs ile önceden nemlendirilmiş bir cerrahi gazlı bez üzerine her iki böbrek yerleştirin. Hızlı bir şekilde herhangi bir yapışık olmayan böbrek dokusu ve böbrek kapsülleri kaldırın. Sonra ayrı ayrı sol ve sağ organın ağırlığı kayıt her böbrek ağırlık.
Tarttıktan sonra, her böbreği pbs olmadan uygun şekilde etiketlenmiş bir tartı teknesine geri yerleştirin ve her organı yarım uzunlamasına kesmek için temiz bir jilet kullanın. Her böbrek yarım aşağı kesilmiş ve iki milimetre veya daha küçük parçalar halinde her yarım kesti yerleştirin. Aynı jilet kullanarak, dikkatlice uygun etiketli 15 mililitre konik tüp içine doğranmış böbrek parçaları aktarın.
Iyi havalandırılan bir duman kaputunda, her tüpe beş mililitre altı azı dişi hidroklorik asit ekleyin. Daha sonra, 90 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu içine tüpler yerleştirmeden önce yavaşça böbrek asidi karışımları ajite. Asit maceration sonunda, böbrek başına bir beş mililitreşile şırınga bir 18 gauge iğne takın ve dikkatle şırınga dalgıçlar çıkarın.
Şırıngaları tek tek 50 mililitrelik konik tüplere duman kaputuna yerleştirin ve böbrek çözümlerini her şırınganın açık ucuna dökün ve boş tüpleri bir test tüpü rafına koyun. Daha sonra 50 mililitrelik tüpler içine iğneler aracılığıyla her çözeltinin yavaş ekstrüzyon için dikkatlice dalma değiştirin. Kalan böbrek dokusunu yatıştırmak için PBS dönen tüp başına pbs çözeltisi beş mililitre ile 15 mililitre konik tüpleryı yıkayın.
Sadece gösterildiği gibi uygun 50 mililitrelik tüp içine yıkama içeriğini ekstrüzyon. Üçüncü yıkama ekstrüzyon sonra, bir 21 gauge iğne ile her şırınga donatmak. 50 mililitrelik tüplerin içeriğini, daha küçük delikli iğne yıkama ve ilk 50 mililitrelik tüpün içeriğini üç kez taze PBS ile ekstrüzyon yoluyla 50 mililitrelik tüplerin ikinci bir setine geçirin.
Üçüncü yıkama ve ekstrüzyon sonra, ek PBS ile 50 mililitreye kadar her tüp toplam hacmi getirmek ve dört derece santigrat bir gecede bir rocker plaka üzerinde bir raf tüpleri yerleştirin. İşlemden sonraki beş gün içinde, 12 kuyuplakasının altı kuyunun altına 16 ayrı bölümden oluşan bir ızgara yerleştirin. Yavaşça peletli dokuları resuspend böbrek çözeltisi tüpleri birkaç kez ters.
Dikkatle 12 kuyu plaka üç kuyuher böbrek başına her homojenize çözelti üç 500 mikrolitre aliquots ekleyin. Her kuyunun içeriğini eşit miktarda PBS ile seyreltin. Plakayı ters bir mikroskobun sahnesine yerleştirin.
Glomeruli'yi küresel yapıları, kırmızımsı tonları ve bireysel glomeruli'nin vücutlarına bağlı arteriyalöncesi veya sonrası ile tanımlayın. Kuyu başına glomeruli toplam sayısının hesaplanması için ızgara başına sayımı toplamı için her ızgaralı bölüm başına glomeruli sayısını sayMak. Sonra böbrek başına glomeruli ortalama sayısını elde etmek için iyi kez 100 başına glomeruli sayısını çarpın.
Bu temsili deneyde, 14 gün boyunca araçla aşılanmış farelerde toplam nefron sayısı böbrek başına yaklaşık 12,500 nefron idi. Anjiyotensin iki infüzyon ancak, cıva yaklaşık 40 milimetre atriyal basıncı arttı ve toplam nefron sayısında önemli bir yaklaşık% 26 azalma ile ilişkili bulundu. Sıçan böbrek agenezisi bu genetik modelde, iki böbrekle doğan hayvanların asit esinasyonu ndan sonra böbrek başına yaklaşık 27, 500 nefron içerdiği hesaplanmış, yalnız böbrekle doğan sıçanların ise toplam nefron sayılarının önemli ölçüde daha düşük olduğu saptandı.
Her iki deneyden elde edilen tahminler, daha önce sıçanlarda bildirilen aralıklarla uyumludur. Asit serpme yöntemi, özellikle disector fraksiyonator yöntemi veya manyetik rezonans görüntüleme gibi nefronları saymak için daha fazla emek yoğun ve maliyet engelleyici tekniklerle donatılmış olmayan laboratuvarlarda, tüm böbreklerde nefron sayılarını tahmin etmek için idealdir. Bu yöntem, manyetik rezonans görüntüleme ile belirlenen sayıların %5'inde olan tüm böbrek nefron sayısının yüksek, verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde tahmin edilmesine olanak sağlar.
Azaltılmış nefron sayılarının kronik böbrek hastalığı gibi kardiyovasküler hastalık riski ile ilişkili olduğu için nefron sayısının değerlendirilmesi klinik bir önemi vardır. Hidroklorik asitle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar paltosu gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.
