Yazarlar nadir hastalık modelleri ve mekanizması (RDMM) ağ (in arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) ve genom Kanada tarafından finanse edilir) teşekkür etmek istiyorum. CK UROP burs ödülü (University of Ottawa) tarafından desteklenir. DLJ Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs tarafından desteklenir. IAP, arayan Sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) doktora sonrası bursu ödülü tarafından desteklenir. Yazarlar genetik Society of izin verme için America tamamlayıcı Şekil 5 Pena, üzerinden bir uyarlaması kullanılacak ve bu protokol yayımlamak için teşekkür ederiz ve ark.

Maddelerle ilgili hayvan konular onaylanmış olan ve hayvan bakımı kılavuzlarınıza uygun olarak çoğu yordamlar Kanada Konseyi tarafından hayvan bakım ve Ottawa Üniversitesi hayvan bakımı komiteler sağlanan.
1. hazırlık
<ol><li>Diseksiyon yüzey 9 cm Petri kabına kapak Otoklav Bandı ile iç yüzeyi taping tarafından hazırlamak. Stereo mikroskop altında yerleştirin.</li>
	<li>Yer 3-5 gün sonrası döllenme (dpf) bir Petri zebra balığı larvaları yemek ve ˜1.5 mm Tricaine 1 x E3 embriyo medya (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7.2) anestezi.</li>
	<li>P1000 pipet ucu makas ya da jilet bir çift ile sonu kapalı 3 dpf larva en az stres ile karşılamak için 2 mm çapında yara bere.</li>
</ol>2. zebra balığı larva fin kırpma
<ol><li>Değiştirilmiş P1000 micropipette kullanarak bir imzalat larva kadar almak ve zebra balığı larva konumlandırılmış Otoklav Bandı üzerine Petri kabına kapağını yerleştirin.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak larva çevreleyen aşırı Tricaine çözüm kaldırın. Alan başarıyla bölüm ve fin kadar almanız mümkün ama hala hayatta kalmasını sağlamak için ıslak kuru olmalıdır.</li>
	<li>Mikro neşter, Bölüm mikroskop stereo Wilkinson ve ark16açıklandığı gibi Şekil 1' de gösterildiği gibi altında kaudal fin kullanarak. Belgili tanımlık kesme sırasında kaudal fin, kan dolaşımını (Şekil 1A) sınırlamak için distal pigment boşluğu sitenin içinde sürekli bir aşağı doğru basınç uygulayın. Notochord zarar görmesini önlemek için hafif basınç uygulayın.</li>
	<li>Mikroskop altında kesitli fin görselleştirmek ve üstünde tepe-in belgili tanımlık uç parçası microscalpel bıçak (Şekil 2A) konumlandırın. Filtre kağıdı küçük bir parça yüzeyinin fin içeren microscalpel yerleştirin. Not: transected doku melanosit varlığı nedeniyle, bu adımı fin görselleştirme bir küçük siyah nokta (Şekil 2B) olarak sağlar.</li>
	<li>Makas ve cımbız (Şekil 2C), transfer 50 mm NaOH çözüm iyi (Şekil 2B) başına 25 μL içeren bir 96-şey PCR plakasına fin içeren filtre kağıdı kullanarak.</li>
	<li>PCR plaka etiket göre iyi numaralandırma bir düz-alt 96-şey plaka hazırlayın. Taze 1 x E3 embriyo medya 200 µL ile dolu değiştirilmiş P1000 pipet kullanarak, dikkatle hafif basınç kullanarak zebra balığı larva toplamak. 96-iyi doku kültürü plaka aynı PCR plaka (Şekil 2E) iyi numara larva dağıtmak.</li>
	<li>Filtre kağıdı de çözüm (2F rakam) sular altında emin olun. Microscapel ve cımbız % 70 alkol çözüm daldırma tarafından çapraz kontaminasyonu önlemek için her kesim arasında bıçak temiz. Bıçak temiz kağıt doku/bezle silin.</li>
	<li>Tüm embriyoların kısaltıldı 2.1-2.7 tamamlayana dek.</li>
	<li>Genotip belirleyinceye kadar larva 96-şey plaka 28 ° C'de depolayın. Not: Embriyo medya iletişim kuralı kolayca az 2 gün içinde tamamlanabilir beri değiştirilmesi gerekmez. Daha fazla zamana ihtiyacım vardı, bir medya değiştir önerilir.</li>
</ol>3. genomik DNA ekstraksiyon
<ol><li>96-şey PCR plaka ve örnekleri için tüm filtre kağıtları emin olmak 1 dk 1000 x g de NaOH çözümünüzde batık santrifüj kapatın.</li>
	<li>Doku lizis için 95 ° c 5 min 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip için bir thermocycler örneklerinde ısı.</li>
	<li>500 mm Tris-HCl, her örnek için 8,0 pH 6 μL ekleyin. Girdap.</li>
	<li>Kısaca, oda sıcaklığında 5 min için 1.500 x g plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir DNA süpernatant PCR reaksiyon başına 1,5 μL kullanın.</li>
	<li>Genotip için PCR larvalar, Tablo 1-2' de gösterildiği gibi hazırlayın. Not: Bu protokol iki uygulamaları için test edildi: multiplex özel jelleri9ve polyacrylamide jel elektroforez (sayfa)17kullanarak genotip ortaya tahlil (HMA) erime heteroduplex kullanarak genotip ortaya PCR reaksiyonları.</li>
</ol>4. alternatif genomik ayıklama şelat bir reçine kullanarak
<ol><li>Filtre kağıdı ile bölünerek fin bir 96-şey PCR plakasına ekleyerek tam adım 2.5 reçine (eşli iminodiacetate iyonları içeren stiren-divinylbenzene kopolimer) şelat % 5'lik 30 μL içeren. Not: Bu tür reçine bir doku lizis ve PCR-hazır DNA bir hızlı ve verimli bir şekilde18' hazırlanması için yaygın olarak kullanılır.</li>
	<li>2.6-2.8 belirtildiği gibi adımları.</li>
	<li>96-şey PCR plaka mühür ve kısaca tüm filtre kağıdı içinde bağlayıcı reçine sular altında emin olmak için örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Doku lizis için bir thermocycler 4 ° C'de 10 dakika için soğutma tarafından takip 15dk için 95 ° C'de örneklerinde ısı. Not: Bu adımı DNA ve RNA çözümde kalırken lizis ve kutup reçine boncuk hücresel bileşenleri için sonraki bağlantısını sağlar.</li>
	<li>Kısaca reçine boncuk cips ve süspansiyon DNA'da edinmek için örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>3.5-3.6 Genotipleme yordamı tamamlamak için adımları izleyin.</li>
</ol>5. uygulama 1: Özel jel analiz tarafından takip Multiplex PCR
<ol><li>Tablo 1, takip homozigoz mutantlar, heterozygotes ve WT larva arasında ayrımcılık sağlamak için çok katmanlı bir PCR reaksiyonu ayarlayın. 96-iyi termal cycler Tablo 3' te açıklanan Bisiklet koşullarını kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirmek için kullanın. Not: PCR reaksiyonları da herhangi bir diğer geleneksel PCR termal cycler içinde gerçekleştirilir. Bu örnek Pena, et al. kullanılan PCR strateji açıklar aldh7a1 WT ve 5-bp ekleme mutant gen aynı multiplex tepki olarak tanımlamak için, 9 .</li>
	<li>% 1'özel jel 1 ile lekeli sodyum borat arabellekte hazırlamak x GelRed. Not: 76 g Borik asit ile 8.5 için ayarlanabilir ve sonra GKD2O. kullanarak 2 L son birim için tamamlandı pH 10 M NaOH, GKD2O, 1800 mL, 40 mL sodyum borat arabellek hisse senedi x 20 yapılan</li>
	<li>V 250 15dk için 1 x sodyum borat arabellekte jel çalıştırın. Sürecini kolaylaştırmak için mümkünse, örnekleri yükleme süresi azaltarak daha yüksek üretilen iş yetenekleri etkinleştirmek için çok kanallı pipets ile uyumlu bir jel sistemi kullanın.</li>
	<li>Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için ultraviyole (UV) ışık altında görüntü.</li>
</ol>6. uygulama 2: Tahlil erime Heteroduplex
<ol><li>SAYFA %12 jelleri 1.5 mm spacer plaka ve 15-örnekleri tarak kullanarak hazırlayın. İki sayfa jelleri 12.21 mL GKD2O, 10 x Tris/bor/EDTA (TBE), 10 mL % 30 akrilamid, 250 μL 2.52 mL % 10 amonyum Persülfat (APS) kullanarak hazırlamak ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 μL. 1 x TBE arabellek kullanın (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M Borik asit ve 0.002 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) arabellek çalışan olarak.</li>
	<li>PCR ürünleri 5 min için 94 ° C'de ısı.</li>
	<li>Tüpler buz veya thermocycler 4 ° C'de 10 dakika serin</li>
	<li>PCR örnek başına 10 μL ve molekül ağırlığı işaretleyicinin 8 μL yük.</li>
	<li>150 V 1 x TBE molekül ağırlığı işaret kadar veya 1 h için neredeyse bir dikey elektroforez sistemi kullanarak ayak hattının cam levha ulaşır. sayfayı çalıştırın.</li>
	<li>Jel farklı genotip ayrımcılık izin vermek için UV ışık altında görüntü.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li><li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders.">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Genome+Editing+Using+High+Efficieny+TALENs.">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency.">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410 (2013).</li><li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae.">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li><li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Disease+mTOR-related+neuropathology+in+mutant+tsc2+zebra+fish+Phenotypic,+transcriptomic+and+pharmacological+analysis.">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li><li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology.">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li><li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish.">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR/Cas9+system.">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420 (2014).</li><li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material.">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li><li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities.">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Son mutasyonlar ve zebra balığı transgenes tam olarak tanıtmak istihdam düzenleme araçları Gene yıl5,6,7,8. Zebra balığı içinde modelleme hastalığı gerçekleştirirken, erken larva veya Juvenil fenotipleri9,12,13,14kez gözlenir. Burada sunulan Protokol...

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın preklinik tedavi hipotezler1,2,3test gelince de hastalık soruşturma için bir model olarak kullanılan omurgalı bir organizma. Bu hayvanlar kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve DNA'ın mikroenjeksiyon embriyo4tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Teknolojik öyle aynı derecede çinko-parmak enzimler (ZFN)5, TAL benzeri efektör enzimler (TALENs)6,7ve kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa roman transgenik ve gen artan geliştirilmesi yoluyla düzenleme Palindromik yineler (CRISPR) / CRISPR ilişkili 9 (Cas9) sistem8, zebra balığı önemli ölçüde birkaç patolojik koşulları anlayış geliştirmek için hazırlanıyor. Hedeflenen renkleri çakıştırma hem de somatik oluşturmak için kullanılan bu teknolojiler ve verimli bir şekilde genetik olarak duyumsatan zebra balığı, hücrelerde germline hayvanlar8değiştirilebilir. Son literatürde epilepsi ve metabolik bozukluklar genetik modellerini başarılı gelişimi zebra balığı3,9,10,11',12 örnekler .
Zebra balığı genom düzenleme içinde ilerleme ile hızlı ve güvenilir Genotipleme yadsınamaz bir hızı sınırlaması adım haline gelmiştir. Belirli DNA mutasyonları öngörülen genom düzenleme hedef siteye bitişik tanımlaması Protokolü'nün önemli bir aşamadır. Geleneksel olarak, Genotipleme fin kırpma tarafından genellikle sadece içinde gerçekleştirilen çocuk ya da yetişkin zebra balığı tekniklerdir. Ancak, harcanan zaman yetişkinliğe yükselterek zebra balığı (> 2 ay) önemli ölçüde araştırma gelişmeler geciktirir. Birçok durumda, yetişkinlik gerekli genler (Örneğin, hastalık modelleme) veya zararlı fenotipik etkileri için önde gelen işlev kazanç mutasyonlar nakavt nedeniyle elde edilemez. Ayrıca, çeşitli deneyleri larva, RNA veya metaboliti ayıklama gibi havuzu gerektirir ve böylece sadece post hoc Genotipleme teknikleri kullanılabilir olduğunda hangi zor olabilir genotip, önceden tanımlanması dahil. Söz konusu bu örnekler aynı zamanda hassas ve tam kurtarma ve larvalar normal gelişimini olanaklı kılmak larva Genotipleme teknikleri önemini vurgulayın. Erken sahne zebra balığı Genotipleme Şu anda yaygın olarak kullanılan görünmüyor; Bu hastalık modelleri larva genotip Genotipleme çalıştırmadan önce deneme12,13,14yerine öldükten sonra Genotipleme üzerinden tespit edilir son yayınlar yansıtır. Bu yazıda, daha önce kurulan Genotipleme yordamlar geliştirmek amaçlayan bir larva fin küçük strateji sunulur.
Geçmişte, İndinavir K sindirim genotip için istihdam stratejileri larva değişken polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) verimlilik15' e açmıştır zebra balığı yaşamak. Daha son zamanlarda mikroskobik kuyruk biyopsi tekniği daha umut verici sonuçları16sağlanan yayınlanan rağmen biz ve diğer grupları yüksek verimlilik ve yazarlar tarafından bildirilen DNA kurtarma çoğaltmak mümkün değildi. Wilkinson ve ark. tarafından açıklanan Protokolü'nün büyük bir başarısızlık 16 kuyruk doku transferi PCR tüp için olabilir. Mikroskobik onun büyüklüğü nedeniyle, fin düzgün toplanan ve pipetting tarafından reçete emin olmak zordur. Bu bariyer adrese, Genotipleme canlı zebra balığı larvaları yaklaşık % 100 verim9ile çok sayıda için geliştirilmiş bir protokol geliştirdik. Bir microscalpel kullanarak, fin kuyruk ucu kaldırılır ve bir filtre kağıt parçası yerleştirilir. Filtre kağıt dokusu içeren kolayca görselleştirildiği ve doğru bir PCR tüp içine yerleştirilir. Genomik DNA ekstraksiyon ardından, genotip örnek ilgi bölgesinin PCR güçlendirme tarafından takip gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajları, yüksek bir PCR verim, düşük bir yanlış pozitif oranı ve düşük ölüm oranı içerir. Ayrıca, çok sayıda embriyo Genotipleme bu iletişim kuralını kullanan mümkündür. Burada açıklanan protokol fin-kırpma, larva bu yaklaşım ve genotyped balık ve kuyruk rejenerasyon iki gün içinde doğru kimlik kullanarak 2-3 saat içinde yüzlerce sağlar.

<table><tbody><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tissue-culture plate</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 sodium form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>paper wipes (Kimwipes&amp;reg; disposable wipers)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus molecylar weight marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system)</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput dna extraction and genotyping of 3dpf zebrafish larvae by fin clipping

Zebra balığı (Danio rerio) insan hastalıkları ile ilişkili olduğu bilinen genlerin % 84 için orthologues sahip. Buna ek olarak, bu hayvanlar bir kısa oluşturma süresi var, kolay işlemek, yüksek bir üreme oranı, düşük maliyetli, görüntülemek ve embriyo içinde DNA'ın mikroenjeksiyon tarafından genetik manipülasyonlar kolayca mükellef bulunmaktadır. Son gelişmeler düzenleme araçları gen mutasyonlar ve zebra balığı transgenes kesin giriş etkinleştirme. Hastalık içinde zebra balığı kez modelleme larva fenotipleri ve genotip bilinmeyen varsa yorumlamak zor olabilir erken ölüme yol açar. Bu erken genotip Ayrıca tanımlamasıdır örnek havuzu gerektiren deneylerde gerekli, gen ifade veya kütle spektrometresi çalışmaları gibi. Ancak, geniş genotypic tarama çoğu labs sadece yetişkin zebra balığı ya da öldükten sonra larva gerçekleştirilen geleneksel yöntemler ile sınırlıdır. Biz bu sorunu bir yöntem gibi erken 72 h sonrası döllenme (hpf) elde edilebilir canlı zebra balığı larva PCR-hazır genomik DNA izolasyonu için adapte tarafından ele. Bu zaman ve maliyet-etkin tekniği, daha önce yayımlanmış Genotipleme Protokolü geliştirilmiş sağlar genotip mikroskobik fin biyopsi üzerinden tanımlaması. Larvalar geliştirdikçe yüzgeçleri hızlı bir şekilde yeniden. Araştırmacılar daha sonra seçin ve istenen genotip yetişkinliğe bu yüksek-den geçerek PCR tabanlı Genotipleme yordamı kullanarak yetiştirmek edebiliyoruz.

Taht verimliliğini Genotipleme tarafından gösterilmiştir Heterozigoz bir çapraz dölü (aldh7a1+ / ot100, burada aldh7a1+/-gösterilen) ()Şekil 3A- C)9. Aldh7a1ot100mutant Gen 5-baz çifti (bp) ekleme ilk kodlama exon frameshift ve fonksiyon kaybı nedeniyle erken bir stop kodonu9yol açar zebra balığı aldh...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping at JoVE.com

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

13.9K Görüntüleme.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Video: High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Genetik

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Gelişim Biyolojisi

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Nörobilim

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarında Floresan Protein Etiketleme

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi