We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

Bu protokol, embriyolar üretme yaşarlar, ergin zebrabalıkları kullanılmasını gerektirir. embriyolar doku toplama hasat edilir. Deney yapmak için uygun etik inceleme kurulları onay almak için esastır. 1. Sahnelenen Embriyolar elde <ol><li> Deneyden bir gün önce, üreme için sağlıklı, yetişkin zebrafish hazırlamak. bir erkek ve bir üretim tankı açık bir bölücünün karşılıklı yanları üzerinde bir dişi yerleştirin. </li><li> alt uygulama için yeterli embriyo üretimi için gerektiği kadar üreme tankları için 1.1 tekrarlayın. ilgi hücre tipinde floresan proteinleri ifade vahşi tip balık ve transgenik balıklar hem embriyolar elde edin. NOT: Adımlar 2-8&#39;de downstream uygulamalar için gerekli embriyo sayısı ilgi bir zaman noktasında ilgi hücrelerin göreceli bolluk bağlıdır. Bu hücre türüne göre değişebilir rağmen, 200 embriyolar 2,000-5,000 sıralı hücreler üretmek zaman cilgi arşın 24 hpf (saat sonra döllenme) de &lt;toplam hücre% 1.0 temsil etmektedir. </li><li> Ertesi sabah, taze bir üreme tankına balık aktararak breading tankındaki suyu değiştirmek ve bölücü çıkarın. üreme teşvik etmek için bir açı tankı yatırın. </li><li> sahnelenen embriyolar toplayın. <ol><li> Her 15 dk, taze üreme tankına yetişkinleri aktarılması ve çay süzgecinden geride yumurta geçerek embriyolar toplamak. NOT: karşılaştırılabilir yoğunlukları ve sıcaklıklarda muhafaza zaman Zebra balığı embriyolar eş zamanlı olarak gelişir. </li><li> (1 L çift distile su içinde 0.21 g / L Anında okyanus tuzları) Yumurta Su ile yumurta durulayın ve bir petri transfer. hava sirkülasyonu ile 28.5 ° C&#39;de nemli inkübatör petri aktarın. </li></ol></li><li> İki saat son toplanmasına, sıralama 10 cm petri kutularının içine çok hücreli embriyo döllenmiş ve çanak başına 50 embriyolar yoğunluğunu azaltır. Tek, 15 seçin embriyolaralt uygulama için toplama dakika zaman penceresi. 28.5 ° C embriyolar inkübe edin. NOT: Örneğin, 08:30, 08:45, 09:00, 09:15, 09:30, 09:45, 10:00 ve 10:15 AM embriyolar toplamak. döllenmiş embriyo en fazla sayıda 9:00 toplanan pençelerinden ise zaman noktalarındaki karşılaştırıldığında, daha sonra aşağı uygulamalar için sadece bu embriyolar kullanın. </li></ol> 2. Tek Hücre Ayrışma için Kurma <ol><li> önce ilgi (18 hpf) zaman noktasına yaklaşık 30 dakika ince forseps ile el koryon embriyolar kaldırmak. </li><li> Toplamak ve her durum için aşağıdaki etiket: İki 2 ml mikrosantrifüj tüpler, bir 40 mikron hücre süzgeç, bir 35 mm hücre kültürü çanak ve 35 mikron hücre süzgecinden ile tepesinde iki FACS tüpleri. </li><li> Buz üzerinde aşağıdaki reaktifler Chill: Yumurta Su 1L çift distile su 0.21 g / L Anında Okyanus tuzları içeren; 55 mM NaCI, 1.8 mM KCI, 1.25 mM NaHCO 3 ihtiva eden tampon De-yolking; ve FACS Tampon Leibovitz L-15,% 5 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş ortam ihtiva etmektedir. </li><li> RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 numune başına 1 ml getirin. buz üzerinde örnek başına çözülme 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2. Kullanmadan önce hemen oda sıcaklığına kadar getirin. </li></ol> 3. Tek Hücre Ayrılma <ol><li> Geniş delikli cam pipet kullanılarak, yumurta suyun minimum bir hacmi içinde 2 ml mikro santrifüj tüpüne 100-300 embriyolar aktarılır. </li><li> 20 dakika boyunca buz içinde tüp 1 ml buz gibi soğuk yumurta su ile su değiştirilmesi ve daldırarak embriyolar öldürülür. DİKKAT! (Ikincil ötanazi gibi hücre ayrışma ardından buz üzerinde ürpertici) bu ötenazi yöntemi için uygun kurumsal hayvan bakım gözetim komitesinden onay almak için çok önemlidir. Standart ötanazi tipik embriyolar da canlı hücreleri elde etmek için uygun değildir ki, soğutulmuş sonra ağartılmalarına nispeten 3 gün sonra gübreleme &lt;gerektirir. </li><li> 1 ml buz gibi soğuk Yumurta suyla embriyolar iki kez yıkayın. yıkamak, Yumurta Suyu ve Yumurta Su eklemek için bir P1000 kaldırmak için geniş bir delik cam pipet kullanın. </li><li> P1000 ucu ile 8-12 kez 1 ml Deyolking Tampon ile embriyo su değiştirilmesi ve öğütülerek sarısı çıkarın veya sarısı çözülür ve kadar embriyoların sadece organları görebilir. </li><li> 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile doku toplanır. yavaşça doku pelet bozmadan süpernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. 1&#39;in ml Yumurta Su yeniden askıya. </li><li> Tekrarlayın üç yıkar toplam adım 3.5, ancak son yıkamada, 1 ml RT Hücre Ayrılma Reaktif 1 yeniden askıya. </li><li> yatay olarak yerleştirilmiş borular ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücre ayrışma Reaktif 1 inkübe edin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için P1000 pipet ile çiğnemek. NOT: ezerek toz haline getirme adımları sırasında hafifçe örnekleri taşıyınız. Bazen tek bir büyük yığın embriyo organları bir arapsaçı gelen tüp içinde oluşacaktır. Bu iradeNazik toz haline getirilerek destekli ek sindirim ile dağıtmak. VORTEKS DO NOT. </li><li> 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile doku toplanır. 1 ml Hücre Ayrılma Reaktif 2 supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında 5-15 dakika boyunca inkübe edin. yatay tüpleri yerleştirin. Her 2-3 dk hafifçe topaklanma önlemek için çiğnemek. Her 5 dk, sindirim ilerlemesini değerlendirmek. <ol><li> , Sindirim ilerlemesini değerlendirmek hücre kültürü çanak üzerine bir damlacık olarak 18 ul FACS Tampon ve pipet içine 2 ul süpernatant sulandırmak için. </li><li> numune üzerinde bir lamel yerleştirin ve 10X ve 20X büyütmede bir doku kültürü mikroskop altında gözlemlemek. NOT: Hazırlık tek hücreler, küçük kümeler, büyük kümeler, ve zaman zaman çoğunlukla-sağlam embriyo vücudun bir karışımı olarak görünmelidir. </li><li> Görme tek hücreleri ve küçük kümeler olan hazırlık oranını değerlendirmek. NOT: Aşırı sindirim canlılığını azaltır; altında sindirim tek hücre verimi azaltacaktır. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücre hazırlama toplayın. Süpernatantı atın ve soğuk FACS Tampon 1 ml yeniden askıya. </li><li> FACS Tampon ile 40 mikron hücre süzgeç ıslatın. 35 mm hücre kültürü çanak üzerine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. tampon sıralama 1 ml FACS hücre süzgeci bir kez yıkayın. </li><li> 2 ml mikrosantrifüj tüp akış yoluyla aktarın. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplamak ve 100 ul FACS tampon içinde yeniden askıya. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücre verimi güvenin. Dahası seçim FACS makine için önerilen ml veya optimum konsantrasyon başına 5x10 6 hücre örnekleri sulandırmak. hemasitometre hücre verimi sayma yaparken isteğe bağlı, tripan mavisi ile counterstain ölü hücreler FACS sıralama öncesinde hücre hazırlık canlılığı teyit etmek. NOT: Çok sıralamak için zaman aşırı miktarda alacak seyreltilmiş Hazırlıklar. çok c vardır Hazırlıklaroncentrated multimerler içine gelme eğilimindedir ve saf nüfus sıralamak için optimal bulunmaktadır. </li><li> Rezerv her numunenin% 10-20 olarak boyanmamış denetimlerini kullanmak için. ekleyerek diğer örnekler, leke ölü hücreler bir floresan ölü / canlı (L / D) ayrım Her numune içine boya. yıkama ETMEYİN. Not: nükleik asitler, L / D boyası olarak kullanılabilir tehlikeye hücre zarları ve lekeleri hücreleri nüfuz herhangi bir flüoresan boya, florasan spektrumu ilgi seçimi ve fluorofor markalama hücrelerinin FACS makine ile uyumlu olması koşuluyla. <ol><li> bazı hücreler FACS saflaştırma transit ölecek ve sıralı nüfus dışında tutulmalıdır olarak boya ekledikten sonra hazırlık yıkamayın. </li></ol></li><li> 20 ul FACS tamponu ile FACS tüp şapkalı 35 mikron hücre süzgeç ıslatın. süzgeç hücreleri ekleyin ve yerçekimi tarafından toplanır. Buz üzerinde muhafaza edin. </li></ol> 4. FACS Zenginleştirme <ol><li> için tek zenginleştirmek için FACS kullanınFloresan markörü eksprese eden canlı hücreler. <ol><li> yan dağılım genlikli (SSC-A) vs ileri dağılım (FSC-A) genlik bir dağılım arsa üzerinde enkaz hücreleri ayırt etmek için bir kapı olarak ayarlayın, hem doğrusal ölçeklendirme ile. Dikkat balığı hücreler tipik olarak bir fare veya insan hücrelerine göre daha küçüktür. Bu hücreler ve döküntüler, arasındaki düşük bir bazal ayırma yansıtılır. </li><li> 4.1.1 set kapısından, tek hücre için zenginleştirmek ve ileri saçılım yüksekliği (FSC-H) ve düşük yan dağılım yüksekliği (SSC-H) bir dağılım grafiğini kullanarak multimerlerini, doğrusal ölçekleme hem dışlamak için bir kapı olarak ayarlayın. NOT: orantısız yüksek FSC-H ve düşük SSC-H hücreler muhtemel multimerleri ve sıralama dışındadır. </li><li> tek renk kontrollerini kullanarak 4.1.2 gate seti, doğrusal ölçekleme ve kanal genliği ile FSA-A&#39;nın bir dağılım grafiği kullanan tek canlı hücreleri dahil bir kapı set günlük ölçeklendirme ile L / D leke tespit etmek için kullanılır. L / D negatif hücreleri içerir. </li><li> itibarenkapı, tek renk kontrollerini kullanarak, 4.1.3&#39;de belirlenen günlük ölçekleme ile floresan protein hücre işaretleyici tespit etmek için kullanılan kanalın lineer ölçeklendirme ve genlik ile FSA-A&#39;nın bir dağılım grafiği kullanılarak pozitif floresan ile tek canlı hücreleri dahil bir kapı set . Pozitif hücreler yer alır. </li><li> Gerekirse L / D leke ve floresan protein spektrumları arasındaki girişim için hesap, herhangi bir tazminat kontrolleri ayarlayın. </li></ol></li><li> Adım 4.1 ayarlanan kapılarının her giren hücrelere ayarlayın sıralama mantığı. <ol><li> çift ​​etiketli hücreleri kullanarak, hücre sıralama için yolluk doğrulayın. NOT: Hücreler yerine enkaz, tek hücreler yerine multimer, L / D negatif ve floresan pozitif hücreler olacaktır sıralama için hücreler. </li></ol></li><li> Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde soğuk FACS Tampon 5 ul içine ilgi nüfus kriteri 2000-4000 hücreleri. hücre için mümkün olan en düşük basınçlar kullanmak, sıralama sırasında hücreler üzerinde kesme ve zorlanma en aza indirmek içinsıralayıcı. NOT: FACS Tampon 5 ul damlacık FACS makinesinden çıkan hücreler için bir yastık görevi görür. şirketinden FACS tamponuna 2000-4000 hücrelerin toplanması öncesinde IFC fiş üzerine yüklemeden santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücreler pelet birbirine bağlı olmadığını santrifüj multimerlerinin oluşumuna yol açabilir, bu strateji, tavsiye edilir. </li><li> sonrası sıralama canlılığı analizi değerlendirin. <ol><li> L / D leke 1000 seyreltme: Transferi 1 ul tampon ve 1 sıralama 100 ul FACS ile taze bir FACS tüp hücreleri sıralanır. Adım 4.1 yolluk stratejisi ile FACS sıralayıcı aracılığıyla hücrelere geçerler. L oranını kullanın / negatiften pozitife D sıralı hücrelerin canlılığı tahmin etmek. </li></ol></li></ol> Mikroakiskan Chip üzerine 5. Yük Hücreleri <ol><li> hemasitometre kullanarak, konsantrasyon ve sıralanmış hücrelerinin boyutunu hem de ölçün. <ol><li> en az 10 ul sıralı hücreleri sulandırmak. 5 u bir kısım seyreltin, 5 ul tripan mavisi ile L hücreleri. hemasitometre üzerine yerleştirin ve lamel uygulayın. </li><li> hemasitometre 4 x 4 ızgaraları tüm hücrelerin parlak bir alan görüntüleri toplamak. Canlı hücrelerinin sayısını ve canlı hücre / ml hesaplar. Canlı hücreler tripan mavisi kadar yapmayız. Not: Tüm canlı hücre çapını ölçmek için herhangi bir standart Image Analysis yazılımının kullanılması. hücre boyutu, ortalama ve standart sapma hesaplayın ve ilgi hücre boyut aralığı için uygun olan bir IFC plaka seçin. Hücre boyutu aralığı bir IFC plaka hücre boyut aralığı straddles ise ilgi hücreleri tam kapsamlı yakalamak için birden fazla tabak kullanın. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına göre IFC plakaya Yük hücrelerinin (Malzeme). <ol><li> 1x10 6 hücre / ml hücreleri sulandırmak ve üreticinin talimatlarına göre yüzdürme optimizasyon yapmak. NOT: Yüzdürme optimizasyon hücreleri dibine çöker, ne de yükleme wel üstüne şamandıra ne sağlarIFC çip üzerine optimum yükleme l. hücrelere tampon oranı hücre tipine göre değişir, ancak genellikle 6 aralıkları olabilir: 4-7: Hücrelerin 3: tampon. </li><li> astar-IFC plakasına hücreleri ekleyin. Yük uyumlu Fluidics makinenin içine plaka ve Mikroakiskan devre boyunca ve yakalama şerit içine hücreleri itmek için bir hücre yükleme komut dosyasını çalıştırın. </li></ol></li><li> Hücreler IFC plaka üzerinde yakalama sitelerinde açılmış olduğunu doğrulamaktadır. <ol><li> Fluidics makineden IFC plakasını sökün. bir tabak adaptörü ile donatılmış bir mikroskop IFC plakasını monte edin. </li><li> 10X büyütmede her yakalama site için parlak bir alan ve floresan anlık toplayın. NOT: aydınlık yakalama süreleri lamba yoğunluğuna bağlı olarak, 10-50 ms arasında değişebilir. Floresan yakalama süreleri fluorofor parlaklığına bağlı olarak, 250-750 ms arasında değişebilir. fotohasar önlemek için hücrelerin ışığa maruz kalmaması. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Sentezi <ol><li> I&#39;e göre yerinde hücre parçalama gerçekleştirinFC plaka üreticinin talimatlarına. <ol><li> IFC plaka üzerinde kuyu lizis tamponları ekleyin. üreticinin talimatlarına göre uyumlu fluidik makine ve çalışma hücre parçalama komut üzerine yük plakası. </li></ol></li><li> IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon gerçekleştirin. <ol><li> IFC plakasına ters transkripsiyon ayraçlar eklenir. Uyumlu Fluidics makine üzerine yük plakası. Ters transkripsiyon komut dosyasını çalıştırın. Örnek döngü koşulları: 5 dakika 85 ° C&#39;de daha sonra da 1 döngü, 10 dakika boyunca 25 ° C &#39;de 1 döngü, 1 saat süre ile 42 ° C&#39; de 1 döngü. </li></ol></li><li> IFC plakası, üreticinin talimatlarına uygun olarak gene özel problar ile ön amplifikasyon gerçekleştirin. Not: düşük kopya numaraları ile daha kesin nedeniyle, ara katkı boyalar ile kullanım için optimize florojenik etiketli problar yerine probları kullanımı. <ol><li> Havuz astar ve son 180 nM her sulandırmak. IFC plakasına toplanmış primerler ekleyin. Uyumlu fluidi üzerine yük plakasıcs makinesi. Run amplifikasyon komut dosyası. </li></ol></li><li> Aşağıdaki çevrim koşulları ön amplifikasyon yapın: 1 döngü, 95 ° C&#39;de 10 dakika, daha sonra da 18 döngü, 4 dakika 60 ° C&#39;de, daha sonra 15 saniye boyunca 95 ° C &#39;de tavlama ve uzatma, denatüre edici ile. Mağaza hasat kadar 4 ° C &#39;de cDNA önceden büyütülmüş. kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de üreticinin talimatlarına ve saklamak için uygun mikroakışkan plakadan Hasat cDNA. </li></ol> Tek Hedef QRT-PCR Tek Hücreleri 7. Select cDNA <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak 25 ul dilüsyon reaktif cDNA seyreltilir. NOT: Yaklaşık son verim hücre başına ön amplifiye cDNA 28 ul. QRT-PCR bir hedef içermeyen bir kontrol olarak kullanılmak üzere bir seyreltici bir kısım ayırın. <ol><li> parlak bir alan ve adım 5.3.2 kaydedilen floresan görüntülere değinen her yakalama sitesine puan. El ile saymak ve hücre sayısını kaydedin. Değerlendirmek ve her hücre grip olup olmadığını kayıtFlüoresan. NOT: Her birey sitesi içerebilir 0,&gt; 1 hücre birden çok hücre ve / veya tanımlanamayan enkaz ihtiva yakalama siteleri içeren 1 veya&gt; 1 hücre. görüntüler yeterli kalitede ise, bir piksel değeri de floresan sinyal yoğunluğu ölçmek için atanabilir. </li></ol></li><li> Mah-PCR analizi için seçin örnekleri. <ol><li> Pozitif floresan ile tam 1 hücreyi ihtiva adım 7.2 tanımlanan yakalama sitelerinden cDNA örnekleri seçin. Her bir numuneden cDNA havuzunu 1 ul alikotları. NOT: Bu ilgi genler seçilen hücrelerin herhangi ifade olup olmadığını belirlemek için kullanılan &quot;Havuz&quot; pozitif kontrol edilmesidir. </li><li> Bir negatif kontrol olarak tam olarak 0 hücreleri içeren en az bir yakalama sitesinden cDNA seçin. no-şablon kontrolü gibi adım 7.1.2 den seyreltici kullanın. </li></ol></li><li> Mah-PCR testi çalıştırın. <ol><li> Aşama 6.4.1 ön-yükseltme için kullanılan tek probları kullanın. triplicat tüm örnekleri yükleyine. 1 döngü, 50 ° C 2 dakika, 1 döngü, 10 dakika için 1, 60 ° C&#39;de, sonra 95 ° C 15 saniye tavlama ve uzatma denatüre edici ile 40 döngü 95 ° C: 384 plaka üzerinde 10 ul reaksiyon için döngü koşulları min. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Standart jel elektroforezi ile Mah-PCR ürünleri doğrulayın. Ürünü onaylamak beklenen molekül ağırlığında tek bir bant olduğunu (her sonda için değişir). NOT: Bir sonda uygunsuz boyutta birden çok bantları veya tek bir bant üretirse, o zaman özgünlüğü sorgulanabilir ve bu analizden geni dışlar. </li><li> Herhangi bir anormallik 14 tüm amplifikasyon eğrileri ve hesabı inceleyin. Her bir numune / gen kombinasyonu 15 için ortalama BT değerini hesaplayın. NOT: Pozitif kontroller CT değerleri tipik 10-30 arasında değişmektedir. Negatif kontroller CT değerleri tipik 35-40 (hiçbir amplifikasyon) arasında değişir. BT değerleri 30-35 derece düşük ifadesi olarak kabul edilirve dikkatli 14 ile yorumlanmalıdır. </li><li> Rapor verileri <ol><li> Numuneler CT = 10-30 düşersen, veriler de bir kontrol numunesine transkript bolluk katlık değişim olarak bildirilebilir. Not: (- ΔΔCT) katlı değişim 2 ^ eşittir ACt ev bakıcısı geni ile ilgili numunenin ortalaması CT çıkarılarak bir ev bakıcısı geni ile ilişkili ve ΔΔCT numunesi ve bir pozitif kontrol 15 ile ACt farklılıklar olduğunu. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis:+toward+the+clinic.">Single-cell analysis: toward the clinic.</a> Genome medicine. 5, (2013).</li><li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+genomics:+advances+and+future+perspectives.">Single cell genomics: advances and future perspectives.</a> PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).</li><li>Marco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifurcation+analysis+of+single-cell+gene+expression+data+reveals+epigenetic+landscape.">Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).</li><li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+single+cell+analysis.">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).</li><li>Garlanda, C., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+endothelial+cells.+Specific+markers.">Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).</li><li>Diaz-Cano, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+heterogeneity:+mechanisms+and+bases+for+a+reliable+application+of+molecular+marker+design.">Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design.</a> International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cellular+hierarchy+by+single-cell+analysis+of+the+cell+surface+repertoire.">Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire.</a> Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Developmental cell. 18, 675-685 (2010).</li><li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+lineage+hierarchies+of+the+distal+lung+epithelium+using+single-cell+RNA-seq.">Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 509, 371-375 (2014).</li><li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+early+development+of+zebrafish.">Genetics and early development of zebrafish.</a> Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).</li><li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development.">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circulation research. 110, 870-874 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li><li>Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA-Seq+and+microarray+in+transcriptome+profiling+of+activated+T+cells.">Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells.</a> PloS one. 9, e78644 (2014).</li><li>McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+non-detects+in+qPCR+data.">On non-detects in qPCR data.</a> Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature. 3, 1101-1108 (2008).</li><li>Lyons, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+and+morphogenetic+defects+in+the+heart+tubes+of+murine+embryos+lacking+the+homeo+box+gene+Nkx2-5.">Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5.</a> Genes &amp; development. 9, 1654-1666 (1995).</li><li>Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+tinman+homolog+demarcates+the+heart+field+and+initiates+myocardial+differentiation.">Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation.</a> Development. 122, 3809-3816 (1996).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-beta+binding+protein+3+identifies+a+second+heart+field+in+zebrafish.">Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish.</a> Nature. 474, 645-648 (2011).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+field+origin+of+great+vessel+precursors+relies+on+nkx2.5-mediated+vasculogenesis.">Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis.</a> Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).</li><li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish:+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type,+developmental+stage+and+chemical+treatment.">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102 (2008).</li><li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+zebrafish+(Danio+rerio)+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization.">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li><li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish.">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li><li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart.">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li><li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field.">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li><li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish.">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li><li>Molina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+modulation+of+transcriptional+bursting+in+a+single+mammalian+gene.">Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tarif edilen yöntem, bir kardiyak genlerin bir alt ekspresyonunu değerlendirmek için mikro-akışkan destekli tek hücre yakalama sisteminde kullanım için zebra balığı embriyolardan kalp progenitör hücrelerin bir popülasyonu ettirecek hücre tipi özel bir promoterin kontrolü altında bir floresan protein ifade kullanır hücreler. FACS lazer eksitasyon ve emisyon özellikleri tercih fluorofor (ler) ile uyumlu olduğu sürece, bu yöntem, herhangi bir flüoresan raportör hattı için kullanılabilir....

hücre ve moleküler biyoloji en güncel çalışmalar nüfus ortalamasına dayanmaktadır. küçük popülasyonlar biyolojik süreçlerin ve hastalık sonucu önemli roller oynayabilir Bununla birlikte, önemli biyolojik olaylar bu geleneksel toplum tabanlı analizler maskelenmiş olabilir. Tek hücre düzeyinde heterojen popülasyonlar gen ifadesini anlama (ve vardır) ilgili biyolojik ve klinik Insights 1,2 yol açabilir. Embriyonik gelişim çalışmalarına ilgilendiren, daha büyük bir hücre popülasyonunda, progenitör hücreler, çoğunlukla az temsil edilmektedir zorlu sonuçta hücre kaderinin kararları 3 başlatmak gen ifadesinde ince değişiklikleri tespit etmek için yapım. Benzer şekilde, tek bir hücre tipi mikro-4 tepki olarak farklı ekspresyon profillerine sahip olabilir. Örneğin, (örneğin., Aort veya böbrek) aynı organ veya farklı organlarda yerleşik endotel hücreleri ortak Morp paylaşımı rağmen önemli heterojeniteye sergilerlerlitolojik ve fonksiyonel özellikleri 5. Buna ek olarak, aynı tümör doldurma kanser hücreleri, aynı zamanda, tek hücre düzeyinde 6 moleküler profiller ya da mutasyonlar farklı olabilir. Modeli sistemlerinde, tek hücre transkriptomik başarılı yeni hücre popülasyonu tespit hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları, özelliği ve 7,8,9 uyaranlara diferansiyel hücresel tepkileri ortaya çıkarmıştır. Bu tür anlayışlar, geleneksel toplum tabanlı çalışmalarda maskeli olurdu. Zebra balığı embriyolar kök, dede bir derece altında kullanılan kaynağıdır ve geliştirme sırasında tek hücre heterojenite ve hücresel kimliklerin moleküler düzenleme soruları keşfetmek için hücrelerin ayırt. Onların son derece basmakalıp, ex vivo geliştirme ve genetik manipülasyon kolaylığı onlara bu yaklaşımın 10,11 için mükemmel bir model sistem olun. Özellikle, tek hücre gen yorumlanması önemli bir sınırlamae ifade veri gelişimi sırasında yeni ara hücre devletlerin güvenilir kimlik doku koleksiyonu 9 çok dikkatli zamanlama gerektirir. Bu tutulan hücre arasındaki farklılıklar, yaşa bağlı hücre farklılaşması tarafından sunulan gen ekspresyonu, tek bir zaman noktasında bir doku içinde heterojen yerine heterojen temsil sağlamak için gereklidir. Fareler ile karşılaştırıldığında, zebra balığı embriyo gelişimi tam olarak embriyoların 12 çok sayıda senkronize edilebilir. Buna ek olarak, geniş bir kavrama boyutları ile, zebra balığı embriyolar kök ve projenitör hücre bol kaynağı olarak kullanılabilir. Bu protokol, zebra balığı embriyoların hücreleri izole etmek ve QRT-PCR ile gen ekspresyon analizi için ticari olarak temin edilebilir, entegre Mikroakiskan devresi (IFC) çipi ve otoprep sistemi kullanılarak tek hücre yakalamak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol, bütün dahil olmak üzere herhangi bir yüksek verimli çoğullama deneyleri hızla devredilecek olabilirHücresel heterojenite 13 daha kapsamlı analiz sağlar transcriptome sıralama. Ayrıca, geleneksel gen sentezleme tahlilleri için çeşitli avantajlar sağlar. Tek hücre izolasyon protokolü alt uygulamalar dahildir tehlikeye hücrelerinin oranını azaltır FACS sonrasında yüksek canlılığı, elde edilir. Bir IFC kullanarak, yakalanan hücreler doğrudan yakalama oranlarını değerlendirmek ve morfolojik hücre sağlığını değerlendirmek için görülebilir. Buna ek olarak, bu protokol mikroakışkan hücre yakalama teknolojileri sadece etiketli transgenik balık hattı ve erişimi gerektiren, Zebra balığı araştırma topluluğuna geniş çapta uygulanabilir. Prensip kanıtı olarak, kalp progenitörlerinden edilen tek hücreler izole edilmiş ve bir IFC çip ele geçirilir ve daha sonra kalp farklılaşma markerlerinin nispi bolluk QRT-PCR ile ölçülmüştür. tek hücre düzeyinde gen ekspresyon analizi kalp atalarıdır kendi differe bir arada gösteriyorntiating soyu. Kalp atalarıdır tek hücreli profil elde edilen anlayış, geleneksel toplum tabanlı analizlerde maskelenmiş olabilir omurgalı gelişimi sırasında kalp progenitör hücreleri arasında gen ekspresyonu heterojenlikten, ışık tutabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>For removing the chorion from embryos</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 um cell strainer</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes topped with 35 um cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC chip manufacturer&#039;s protocol</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Version 100-6117 E1 was used in representative experiment</td></tr><tr><td>Wide bore pastuer glass pippette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Adult wild type zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used AB line</td></tr><tr><td>Adult transgenic zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for cell dissociation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double distilled water</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Heat inactivate; any brand of FBS should be fine</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use</td></tr><tr><td>pronase (optional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for IFC plate use and qRT-PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific probes</td><td></td><td></td><td>Probes will vary by experiment</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Reagents listed in IFC manufacturer&#039;s protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reagents for loading cells onto IFC plate</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CT&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps</td></tr><tr><td>Molecular Biology Quality Water</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC for PreAmp (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>IFC plate for small cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep machine</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>For IFC plate use</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>For counting cells and assessing cell size</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>For removing embryos from chorion</td></tr><tr><td>Tissue culture microscope</td><td></td><td></td><td>For assessing single cell digestion</td></tr><tr><td>FACS machine</td><td></td><td></td><td>For isolating cells of interest</td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of single cells from zebrafish embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Prensip kanıtı olarak, gen ifadesi kalp gelişimi sırasında farklılaşma dinamikleri keşfetmeye değerlendirildi. zebrabalıkları kardiyak ataları Bunların, doğrusal kalp tüpü oluşturmak için sigorta ön yan levha mezoderm yer değiştiren hücrelerin mezodermal nüfusu ortaya çıkar. Füzyon öncesinde, kalp ataları kalp atalarıdır 16,17 erken belirli belirteç olduğu düşünülmektedir transkripsiyon faktörü Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), ifade başl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos at JoVE.com

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.4K Görüntüleme.  University of North Carolina at Chapel Hill. This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells. 

Video: Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Nörobilim

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Genetik

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak Hücrelerinin İşlenmesi

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Yazar Gündemi: Gastrointestinal Gelişimin Transkriptomik Yönlerini Araştırmak için Zebra Balığı Larvalarının Bağırsak Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Analiz Edilmesi 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı