이 작품은 미국 심 혼 협회 [H.L.에 특정 0365274B]에 의해 지원 되었다 국립 암 연구소 [Z.W. GI 포자 P50CA150964], 건강의 국가 학회 [사무실의 연구 인프라 공유 계측 그랜트 S10RR031845에 가벼운 현미경 검사 법 케이스 서쪽 예비 대학에서 시설 이미지], [X.G.]를 중국 장학금 위원회. 저자는 슬라이드 스캔 빛 현미경 이미징 핵심 그의 도움에 리처드 리를 감사 합니다.

여기에 설명 된 쥐를 포함 하는 실험의 모든 케이스 서쪽 예비 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 2016-0068 프로토콜의 제목 (PI: 화 루)은 "척추 개발에 대체 이전 mRNA 접합의 역할".
참고: 모든 장비, 시 약 및 공급이이 프로토콜에 사용 되는 정보 자료의 테이블에에서 포함 됩니다.
1. 준비 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (FFPE) 섹션
<ol><li>
자 궁 경부 전위에 의해 1 CD1 마우스와 1 C57BL/6J 마우스를 안락사. 조심 스럽게 잘라 오픈 수술가 위, 집게와 두개골. 특 종으로 두뇌를 제거 합니다. 참고: 5 개월 CD1 남성 생쥐와 3 개월 된 C57BL/6J 남성 마우스 사용 되었고 비슷한 결과 보였다.<ol>
<li>PBS와 뇌를 씻어. 전체 뇌 말린 솔루션 50 mL에 넣어 실 온 (RT)에서 10% 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 30 h 전체 뇌를 해결.</li>
		<li>PBS를 고정 솔루션을 변경 하 고 하룻밤 4 ° c.에 PBS에 뇌를 품 어 탈수 하 고 크 실 렌 그리고 파라핀 표준 절차18를 사용 하 여 두뇌를 포함.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
톰을 사용 하 여 포함 된 조직 5 µ m 섹션으로 잘라. 첫 번째, 그리고 리본으로 45 ° C 물 욕조에 파라핀 리본 RT 물 욕조에 넣어.
	<ol>
<li>주름과 주름 리본에서 사라질 때 즉시 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 사용 하기 전에 60 ° C에서 1 시간에 대 한 실시간 빵 슬라이드에서 하룻밤 건조 슬라이드에 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샘플 전처리
<ol><li>
조직 단면도 deparaffinize 증기 두건에서 이러한 단계를 실시 합니다.
	<ol>
<li>신선한 크 실 렌과 2 100% 에탄올의 250 mL의 250 mL로 두 세척 접시 (그림 1A)를 채우십시오. 다음 표 1에 표시 된 순서 및 보육 시간 세척 요리에서 랙 세척 세척 랙 (그림 1A) 장소에 조직 슬라이드를 삽입 합니다.</li>
		<li>각 인큐베이션 기간 동안 리프트 세척 랙 아래로 3 회 이상 세척 접시에. 각 부 화 후 신속 하 게 밖으로 건조에서 조직 단면도 방지 하기 위해 다음 세척 접시에 세척 랙을 이동 합니다.</li>
		<li>부 화 단계를 완료 한 후 세척 접시에서 슬라이드와 세척 선반을 제거 합니다. 랙 슬라이드는 완전히 건조 될 때까지 또는 5 분 동안 60 ° C 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소수 성 장벽 펜 조직 단면도 둘러싼 0.75 "x 0.75" 배리어를 그립니다. 공기 건조 3 분 실시간에 대 한 장벽</li>
	<li>
분할 영역을 pretreat
	<ol>
<li>시 약 및 장비 준비<ol>
<li>교 잡 오븐 (그림 1B)를 켜고 온도를 40 ° C 사용 하기 전에 30 분 설정.</li>
			<li>증류수와 humidifying 종이 (그림 1E)를 완전히 습식 및 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣어. 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.</li>
			<li>10 x 대상 검색 시 약 70 mL를 dH2O의 630 mL을 추가 하 여 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 700 mL를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>과산화 수소를 적용 합니다.<ol>
<li>벤치에 deparaffinized 슬라이드를 넣어. 완전히 커버 조직 섹션에 과산화 수소의 5-8 방울을 추가 합니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어</li>
			<li>과산화 수소 솔루션을 한 번에 한 슬라이드를 제거 하는 흡수 성 종이의 조각에 슬라이드를 누릅니다. 즉시 세척 랙에 슬라이드를 삽입 하 고 세척 접시 가득 dH2오 랙 이동</li>
			<li>대 한 증류수에 랙을 아래로 이동 하 여 슬라이드를 씻어 3-5 시간. 세척 접시 가득 신선한 증류수 세척 슬라이드 한 번 더 세척 랙을 이동 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>대상 검색 수행<ol>
<li>뜨거운 접시에 1000 mL 유리 비 커를 놓습니다. 비 커에 700 mL 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 추가 호 일로 다룹니다. 포 일 덮개 (그림 1C)을 통해 비 커에 온도계를 넣습니다. 핫 플레이트를 켜고 높이 10-15 분에 대 한 설정.</li>
			<li>검색 시 약의 온도 98 ° C에 도달 하면, 가벼운 종 기를 유지 하기 위해 낮은 높이에서 핫 플레이트의 온도 제어를 전환 합니다. 15 분 이상 끓여 야 하지 않습니다.</li>
			<li>한편, 신중 하 게 포 일을 열고 검색 젠 내부 조각와 세척 선반을 넣어. 다시 비 커를 커버 하 고 15 분 동안 품 어.</li>
			<li>세척 접시를 비 커에서 선반을 제거 하려면 사용 하 여 집게 dH2O와 15 린스 200ml 가득한 s.</li>
			<li>포함 하는 100% 신선한 에탄올 세척 접시 랙 이동 그리고 앉아 3 분 슬라이드를 제거 하 고 10 분 동안 60 ° C 배양 기에서 그들을 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>프로 테아 제 III를 적용<ol>
<li>얼룩 랙 (그림 1D, 오른쪽)에 슬라이드를 놓습니다. 조직 커버 프로 테아 제 3의 5 방울을 추가 합니다. 조심 스럽게 랙 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣고 40 ° C 교 잡 오븐으로 트레이 삽입. 30 분 동안 품 어.</li>
			<li>슬라이드 랙 제거 하 고 다시 오븐에 트레이 넣어. 제거 초과 액체, 한 번에 한 슬라이드에 슬라이드를 누릅니다. 세척 랙에서 슬라이드를 삽입 하 고 장소 세척 접시에서 랙 가득 dH2오 이동에 대 한 슬라이드를 아래로 랙 3-5 시간.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 분 분석 결과
<ol><li>
재료 준비
	<ol>
<li>미리 따뜻한 워시 버퍼 워시 버퍼 x 1을 x dH2O 및 50의 60 mL 20 분 혼합 2.94 L에 40 ° C 인큐베이터에 워시 버퍼 x 50.</li>
		<li>DH2dH2오 믹스의 250 mL에 1 N 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 수술 준비 0.02% (w/v) 암모니아 물 100 mL를 컨테이너에 잘 하는 길의 되며 100 mL를 추가 하 여 50% 되며 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>프로브와 앰프 0-6 사용 하기 전에 RT 30 분 시 약. 40 ° C 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
틱 절차 참고: isoforms를 접합 하는 n f 1 의 식 검사 하 고 exon 23a, 3 다른 분 프로브 exon 23a 포함 isoform, 대상에 대 한 값 (PSI)에 접합 하는 백분율을 계산 하려면 exon 23a 제외 isoform 또는 두 isoforms는 사용된 (그림 2 ). 프로브 adjacently 컷된 직물 단면도에 사용 됩니다. 계산의 정확도 보장 하기 위해, 그것은 3 개의 직물 단면도 처리 됩니다 중요 한 교 잡, 증폭 및 신호 감지 단계에서 정확 하 게 동일.<ol>
<li>교 잡 조사.<ol>
<li>세척 선반에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드에서 과잉 액체를 누릅니다. 얼룩 랙에서 슬라이드를 놓습니다.</li>
			<li>연필을 사용 하 여 프로브 이름으로 슬라이드를. 3 다른 Nf1 프로브 (그림 2)와 함께 때 교배 수 세 adjacently 컷된 뇌 조직 슬라이드를 넣어. 슬라이드의 순서에서 다음 단계를 실시 합니다.</li>
			<li>프로브는 조직 커버를 4 방울을 추가 합니다. 섹션 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 한 번에 한 슬라이드를 할. 습도 제어 트레이에 얼룩 선반을 놓고 2 시간 동안 40 ° C 오븐에 삽입 합니다.</li>
			<li>씻어 슬라이드 두 번 버퍼를 세척. 각 세척에 대 한 얼룩 요리 워시 버퍼 x 1의 200 mL와 함께 그것에 세척 선반을 배치. 한 번에 종이 타월 한 슬라이드에서 과잉 액체를 누르고 신속 하 게 세척 랙에 삽입 합니다. 대 한 접시에 아래로 슬라이드 랙 이동 실시간 2 분에 대 한 3-5 시간</li>
			<li>두 번째 세척에 대 한 신선한 워시 버퍼를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호의 증폭<ol>
<li>슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 앰프는 조직 커버를 0 4 방울을 추가 합니다. 습도 제어 트레이에 얼룩 랙 하 고 40 ° c.에 30 분 동안 오븐에 넣고</li>
			<li>씻어 슬라이드 두 번 설명한 것 처럼 버퍼를 세척.</li>
			<li>1-6 다음 순서 및 조건 표 2의 앰프와 함께이 단계를 반복 합니다. 두 번 각 교 잡 단계 후 슬라이드를 씻어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호 검출<ol>
<li>슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 빨리 레드의 120 µ L에 빨리 레드 B의 2 µ L를 추가 microcentrifuge 튜브에서 (1:60 비율). 잘 혼합 하 고 완벽 하 게 커버 조직 섹션에 추가. 참고: 빨간색의 총 볼륨 수와 조직 섹션의 크기를 기반으로 하는 B 믹스 /. 0.75 "x 0.75" 지역, 120 µ L 충분 한 부분입니다. 5 분 이내 믹스를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 자외선 믹스의 노출을 피하십시오.</li>
			<li>트레이 닫습니다 및 폐기물 컨테이너 솔루션 실시간 제거에서 10 분 동안 품 어 및 즉시 세척 랙 슬라이드 삽입 선반을 두십시오는 수돗물 가득 세척 접시에. 다시 물으로 씻어 신선한 수돗물.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 counterstaining
	<ol>
<li>수도 물에서 세척 랙 제거 하 고 신속 하 게 여분의 물을 제거 하는 흡수 성 종이에 누릅니다. 50% 되며 솔루션 얼룩으로 선반을 넣고 즉시 여러 번 위아래로 랙 이동. 실시간에서 2 분 동안 품 어</li>
		<li>슬라이드 랙 수돗물 접시에 다시 전송 합니다. 선반을 위와 아래로 이동 하 고 슬라이드 뇌 조직 유지 보라색 명확 하 게 될 때까지 신선한 수돗물을 변경 하 여 3-5 회 세척.</li>
		<li>랙 0.02% 암모니아 물을 포함 하는 접시에 이동. 랙 아래로 2-3 회 때까지 이동 조직 푸른색. 슬라이드 3-5 번 얼룩 요리에 신선한 수돗물으로 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플의 설치
	<ol>
<li>60 ° C 인큐베이터에 얼룩 요리에서 슬라이드 랙 이동 하 고 슬라이드 완전히 건조 될 때까지 적어도 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>슬라이드에 장착 매체의 40 µ L을 놓고 신중 하 게 조직 섹션 24 m m x 50 m m coverslip를 배치 합니다. 실시간에서 30 분 동안 공기 건조 슬라이드</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 수집 및 분석
참고: 40 X 배율에서 이미지를 스캔 하는 슬라이드 스캐너를 사용 합니다.
<ol><li>
긍정적이 고 부정적인 컨트롤
	<ol>
<li>각 실험에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (그림 3)을 포함 합니다. 좋은 긍정적인 제어 신호는 20-40 X 확대 punctate 점으로 표시 되어야 합니다.</li>
		<li>사용 마우스-PPIB-1ZZ 긍정적인 제어로 (Mm). 이 프로브는 일반적인 내부 관리 유전자 PPIB 대상. 부정적인 통제에 대 한 모든 20 셀 배경 20 X 현미경 필드 얼룩을 표시 한 점을 허용 됩니다.</li>
		<li>DapB 1ZZ 프로브를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. 이 조사 대상 세균 유전자 dapB. 이러한 제어 프로브 많은 분 분석 실험19에서 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 검출 및 Nf1 exon 23a의 식 패턴으로의 분석
	<ol>
<li>교 잡 신호는 punctate 점으로 표시는, 수동으로 점 들을 계산 합니다. 도트 수 특정 조사에 의해 감지 되는 성적 증명서의 수준으로 상관 된다. 참고 도트 수 또한 ImageJ 또는 SpotStudio 소프트웨어에 의해 분석 될 수 있다.</li>
		<li>3 개의 프로브를 사용 하 여 교배 exon 23a 포함, 엑손 23a 부족 isoforms, 또는 총 Nf1 성적표 (그림 2). 3 개의 프로브를 동시에 사용할 수 없습니다, 3 개의 인접 한 뇌 조직 섹션 사용 하 여 각 프로브에 교배를.<ol>
<li>Exon 23a에 대 한 (PSI)에 접합 하는 %를 계산 하려면 셀과 몇몇 두뇌 지구에서 점 들의 수를 계산 합니다. 관심의 각 지역에 대해 그림 4에 표시 된 대로 여러 하위 영역에서 400 개 이상의 셀을 계산.</li>
			<li>각 3 개의 프로브에 대 한 동일한 하위 영역에서 데이터를 수집 합니다. 셀 당 도트 수로 계산 하는 exon 23a 포함 프로브 PSI / (exon 23a 포함 프로브 + 프로브를 건너뛰는 exon23a 셀 당 도트 수로 셀 당 점의 수) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 통신 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 검사 BaseScope RNA의 사용을 보고 합니다. 그것은 그 반대로 감각 엑손-엑손 접합 프로브 exon 포함 하 고 견고 하 게 하 고 특히 isoforms를 건너뛰는 50 뉴클레오티드 대상 보다 짧은 시연입니다. 또한, 결과 신호 대체 exon의 PSI를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
몇 가지 유사 절차에서 테스트 되었습니다. 예를 들어 냉동된 조직 단면도 cr...

대안 접합 (AS)는 사전 mRNA 성숙 하는 동안 발생 하는 일반적인 과정입니다. 이 과정에서는 exon 차동 성숙한 mRNA에 포함 될 수 있습니다. 따라서, AS, 통해 한 유전자 생성할 수 있습니다 많은 mRNAs 다른 단백질 제품에 대 한 코드. 그것은 추정 인간 유전자의 92-94% 대체 접합1,2를 받 다. 비정상적인 대안 접합 패턴에서 결과 유전자 변이 루 경화 증, 암3,4, myotonic 영양 장애 등 질병의 많은 수에 연결 되었습니다. 따라서 조사 하 고 인간의 질병의 새로운 치료법을 찾을 하려고 대체 접합 규제 메커니즘 이해 결정적 이다.
마찬가지로 종종 셀 형식 관련 패션에서 통제 된다. 그것은 생물 학적 시스템에서 특정 유전자의 AS 식 패턴을 결정 하는 것이 중요입니다. 그러나,이 세포, 심장, 뇌 등의 다양 한 종류를 포함 하는 복잡 한 기관 공부 때 복잡 한 됩니다. 이 경우에, 분석 결과 시스템의 이상적인 선택 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) 티슈를 사용 하 여 특정 유전자의 AS 식 패턴 동시에 많은 세포 유형에서 검출 될 수 있다 그래서 섹션입니다. 실제로, exon 전용 프로브 대체 exon5,,67의 식 수준을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나,이 방법은 아니다 적합 패턴 분석으로 다음과 같은 이유로. 첫째, 기존의 틱 방법 일반적으로 사용 하는 프로브 300 이상 혈압, 척추 내부 exons (하지 첫 번째 또는 마지막 exon)의 평균 크기는 170 뉴클레오티드8,9. 둘째, 내부 양자 택일 exon의 접합 패턴을 검사 하는 exon 전용 프로브를 사용 하는 경우 조사에 의해 감지만 mRNA isoform는 exon를 감지할 수 없습니다 없이 mRNA isoform 동안 exon를 포함 하 이다. 따라서, 양자 택일 exon (PSI) 값에 접합 %의 계산 복잡 하다. 또한, 기존의 형광 틱 종종 결합 분 immunostaining, 검출 효율 및 견고성을 감소 시키는. 예를 들어 스트레스 유발 조사 연구에서 isoform acetylcholinesterase (통증)의 스위칭 접합 mRNA, digoxigenin 분 탐침에 통합 했다 및 안티-digoxigenin 항 체를 사용 하 여 감지. 또는, biotin 표시 된 프로브는 알칼리 성 인산 가수분해 효소/streptavidin 공액 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소10기판에 의해 검색 되었습니다. 어느 방법 탐지의 감도 증가 어떤 확대 전략을 사용 합니다. 결과적으로, 그것은 낮은 수준에서 표현 되는 mRNA 사본 검색 도전 이다. 따라서, 간단 하 고 더 강력한 분 분석 결과 시스템은 식 패턴에서 제자리에분석 필요 합니다.
BaseScope는 RNAscope, 잘 설립의 플랫폼에 따라 최근 개발 하 고 널리 이용 되는 분 분석 결과 시스템. 두 분석 결과 시스템 탐지11,12의 감도 증가 하는 특정 대상 증폭 기술을 사용 합니다. 어떻게 구별 하나에서 다른 짧은 BaseScope에 대 한 50 뉴클레오티드 및 RNAscope에 대 한 300-1000 뉴클레오티드는 대상 시퀀스의 길이입니다. 따라서, 디자인 조사 대상 엑손-엑손 접합 특정 대체 mRNA isoforms를 감지 하는 것이 가능 하다. 현재 연구에서 프로시저 neurofibromatosis 식 패턴 입력 1 (Nf1) exon 23a, 같은 실험실13,,1415 에 광범위 하 게 공부 하는 대안 exon 검사 설립 , 16 , 17, 마우스 뇌 섹션에서. 결과 BaseScope는 Nf1 exon 23a 제자리의 식 패턴을 공부 하는 이상적인 시스템을 보여 줍니다. 이 분석 결과 시스템 많은 양자 택일 exons의 표현 패턴 분석에 적응 될 수 있는, 그것은 다른 이름으로의 연구에 강력한 새로운 도구 대표

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

대안 접합 (AS)는 인간 유전자의 90% 이상에서 발생합니다. 양자 택일로 접합된 한 exon의 표현 패턴 셀 형식 관련 패션에서 자주 통제 된다. 패턴은 일반적으로 RT-PCR 및 RNA-seq 분석 식으로 RNA 샘플을 사용 하 여 셀의 인구에서 고립. 현장에서 시험의 특정 생물 학적 구조에 대 한 식 패턴으로는 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) exon 전용 프로브를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 양자 택일 exons는 일반적으로 너무 exon 전용 프로브 디자인 때문에,의 사용이 제한 되었습니다. 이 보고서에서 BaseScope, 짧은 센스 oligonucleotides RNA 분에를 사용 하 여 최근에 개발 된 기술을 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 분석 설명 되어 있습니다. Exon 23a neurofibromatosis 유형 1 (Nf1)의 짧은 엑손-엑손 접합 프로브 마우스 뇌 섹션에 RNA 분 분석에 높은 특이성을 가진 강력한 교 잡 신호를 전시 설명 하기 위해 예제로 사용 됩니다. 더 중요 한 것은, exon 포함 및 건너뛰는 특정 프로브와 감지 신호 안정적으로 마우스 뇌의 다른 해 부 영역에 Nf1 exon 23a 식의 값에 접합 하는 퍼센트 계산을 사용할 수 있습니다. 실험 프로토콜 및 분석에 대 한 계산 방법 선물 된다. 결과 BaseScope 식 패턴에서 제자리에로 평가 하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다 나타냅니다.

BaseScope 분 3 마우스 종자를 사용 하 여 실시 되었다: CD1 야생 타입 마우스, C57BL/6J 야생 타입 마우스 및 C57BL/6J 배경, 어떤 exon에 23a의 결과로 모든 셀 형식에 포함 되어 있는 n f 123aIN/23aIN 돌연변이 쥐 스플라이스 사이트 설계 변이14,15.
첫 번째 단계로 분 분석 결과 시스?...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Universidad San Sebastian

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Cell Biology

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K 조회수.  Case Western Reserve University. 현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

연구

유전학

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

암 연구학

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

신경과학

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

생물학

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

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절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여

더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출

더블 형광 결합

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections