Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del cuore [sovvenzione dai 0365274B a H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 a Z.W.], National Institutes of Health [Ufficio di ricerca infrastrutture condivise strumentazione Grant S10RR031845 a la microscopia chiara Imaging Facility presso Case Western Reserve University] e del Consiglio di borsa di studio di Cina [a X.G.]. Gli autori ringraziano Richard Lee nel nucleo Imaging microscopia luce per il suo aiuto con scivolo di scansione.

Tutti gli esperimenti descritti qui che coinvolgono i topi sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali con istituzionale Case Western Reserve University. Il titolo del protocollo 2016-0068 (PI: Hua Lou) è il "Ruolo di impionbatura alternativo pre-mRNA in vertebrate development".
Nota: Le informazioni di tutte le attrezzature, reagenti e materiali di consumo utilizzati nel presente protocollo sono incluso nella Tabella materiali.
1. preparare la formalina fisso paraffina (FFPE) sezioni incorporate
<ol><li>
Eutanasia 1 CD1 ed 1 mouse C57BL/6J di dislocazione cervicale. Accuratamente tagliato aperto il cranio con forbici e pinze. Rimuovere il cervello con una paletta. Nota: topo maschio di 5 mesi CD1 e topi maschii di C57BL/6J 3 mesi sono stati utilizzati e ha mostrati risultati simili.<ol>
<li>Lavare il cervello con PBS. Riparare il cervello con una soluzione contenente formalina al 10% a temperatura ambiente (TA) per 30 h mettendo l'intero cervello in 50 mL di soluzione di formalina.</li>
		<li>Modificare la soluzione di fissaggio in PBS e incubare il cervello in PBS durante la notte a 4 ° C. Disidratare e incorporare il cervello con xilene e paraffina utilizzando le procedure standard18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizzare un microtomo per tagliare il tessuto incorporato in 5 sezioni di µm. Mettere il nastro di paraffina a bagnomaria RT prima e poi in un bagno di acqua 45 ° C per diffondere la barra multifunzione.
	<ol>
<li>Quando scompaiono le rughe e le pieghe sulla barra multifunzione, montare immediatamente sezioni sulle lastre di vetro. Aria secche diapositive durante la notte alle diapositive RT. cuocere per 1 h a 60 ° C prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pretrattamento del campione
<ol><li>
Deparaffinizzare sezioni di tessuto. Eseguire questi passaggi in una cappa aspirante.
	<ol>
<li>Riempire due piatti di lavaggio (Figura 1A) con 250 mL di xilene fresco e due con 250 mL di etanolo al 100%. Inserire le diapositive del tessuto in un lavaggio rack (Figura 1A) e posto il lavaggio cremagliera a lavare i piatti dopo la data di ordine e incubazione indicata nella tabella 1.</li>
		<li>Durante ciascuna incubazione, sollevate il vassoio di lavaggio su e giù più di 3 volte nel piatto lavaggio. Dopo ciascuna incubazione, spostare rapidamente il rack di lavaggio nel piatto successivo lavaggio per evitare che le sezioni di tessuto dall'asciugarsi.</li>
		<li>Dopo aver completato le fasi di incubazione, togliere la rastrelliera di lavaggio con scivoli dal piatto di lavaggio. Mettere la griglia in un incubatore a 60 ° C per 5 minuti o fino a quando le diapositive siano completamente asciutte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disegnare una 0,75 '' x 0.75 ' barriera che circonda la sezione di tessuto con una penna di barriera idrofoba. Aria secca la barriera per 3 minuti a TA.</li>
	<li>
Pretrattare fette
	<ol>
<li>Preparare i reagenti e le attrezzature<ol>
<li>Accendere il forno di ibridazione (Figura 1B) e impostare la temperatura a 40 ° C 30 min prima dell'uso.</li>
			<li>Bagnare completamente la carta umidificazione (Figura 1E) con acqua distillata e metterlo nel vassoio di controllo umidità (Figura 1, sinistra). Tenere il vassoio di controllo di umidità nel forno ibridazione.</li>
			<li>Preparare 700 mL di 1x fresca destinazione recupero reagenti aggiungendo 630 mL di dH2O a 70 mL di 10 x destinazione recupero dei reagenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare il perossido di idrogeno.<ol>
<li>Mettere le diapositive Sparaffinatura in panchina. Aggiungere 5-8 gocce di perossido di idrogeno a una sezione da ricoprire completamente il tessuto. Incubare per 10 min a RT.</li>
			<li>Toccare le diapositive su un pezzo di carta assorbente per rimuovere la soluzione di perossido di idrogeno, una diapositiva alla volta. Immediatamente inserire la diapositiva in un rack di lavaggio e spostare il rack in un piatto di lavaggio riempito di dH2O.</li>
			<li>Lavare i vetrini spostando il rack su e giù in acqua distillata per 3 – 5 volte. Spostare il rack di lavaggio in un piatto di lavaggio riempito con acqua distillata e lavare una volta di più.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire il recupero di destinazione<ol>
<li>Posizionare un bicchiere di vetro di 1.000 mL su un piatto caldo. Aggiungere 700 mL di 1x fresca destinazione recupero reagenti nel becher e coprirlo con un foglio. Inserire un termometro nel becher attraverso la pellicola di copertura (Figura 1). Accendere la piastra e impostato su high per 10 – 15 min.</li>
			<li>Quando la temperatura dei reagenti di recupero raggiunge 98 ° C, è possibile passare il controllo della temperatura della piastra riscaldante da alta a bassa per mantenere un lieve bollore. Non bollire più di 15 min.</li>
			<li>Nel frattempo, attenzione aprire la pellicola e mettere la griglia di lavaggio con fette dentro il reggente di recupero. Coprire il becher nuovamente e incubare per 15 min.</li>
			<li>Uso forcipe per togliere la rastrelliera dal Becher per un piatto di lavaggio riempita con 200 mL di dH2O e risciacquare per 15 s.</li>
			<li>Spostare il rack in un piatto di lavaggio contenente etanolo al 100% e lasciate riposare per 3 minuti togliere i vetrini e farli asciugare in un incubatore a 60 ° C per 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare proteasi III<ol>
<li>Porre i vetrini sul rack macchia (Figura 1, destra). Aggiungere 5 gocce di proteasi III per coprire il tessuto. Accuratamente messo il rack nella barra di controllo umidità (Figura 1, sinistra) e inserire il vassoio del forno di ibridazione di 40 ° C. Incubare per 30 min.</li>
			<li>Rimuovere il portavetrini e rimettere il vassoio nel forno. Toccare le diapositive per rimuovere il liquido in eccesso, una diapositiva alla volta. Inserire la diapositiva in un rack di lavaggio e posizionare la cremagliera in un piatto di lavaggio riempita di dH2O. spostare il rack su e giù per lavare i vetrini per 3 - 5 volte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH Assay
<ol><li>
Preparare i materiali
	<ol>
<li>Pre-riscaldare 50 x tampone di lavaggio in un incubatore a 40 ° C per 20 min. Mix 2,94 L di dH2O e 60 mL di 50 x tampone di lavaggio per fare il tampone di lavaggio 1X.</li>
		<li>Preparare soluzione colorazione ematossilina al 50% con l'aggiunta di 100 mL di ematossilina di Gill I per 100 mL di dH2O. Prepare 0,02% (p/v) ammoniaca acqua aggiungendo 1,43 mL di idrossido di ammonio N 1 a 250 mL di dH2O. Mix bene in un contenitore.</li>
		<li>Mettere le sonde e AMP 0 – 6 reagenti a RT 30 min prima dell'uso. Tenere il vassoio di controllo di umidità nel forno di ibridazione di 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura di ISH Nota: Per esaminare l'espressione di Nf1 isoforme di splicing e calcolare la percentuale impiombata in valore (PSI) per esone 23a, tre diverse sonde ISH destinati a esone 23a-incluso isoforma, esone 23a-escluso isoforma o entrambe le isoforme sono usati (Figura 2 ). Le sonde sono usate su sezioni di tessuto adiacenti taglio. Per garantire la precisione del calcolo, è fondamentale che le sezioni di tre tessuto sono trattate esattamente lo stesso nei passaggi di rilevamento segnale, amplificazione e ibridazione.<ol>
<li>Sonda di ibridazione.<ol>
<li>Rimuovere le diapositive dal rack lavaggio e toccare il liquido in eccesso dalle diapositive. Porre i vetrini in rack macchia.</li>
			<li>Utilizzare una matita per marcare i vetrini con il nome di sonda. Mettere le diapositive di tessuto di cervello adiacenti taglio tre per essere ibridate insieme con tre diverse sonde di Nf1 (Figura 2). Eseguire i passaggi successivi nello stesso ordine delle diapositive.</li>
			<li>Aggiungere 4 gocce di sonda per coprire il tessuto. Fare questa una diapositiva alla volta per evitare che le sezioni dall'asciugarsi. Mettere la griglia di macchia nella barra di controllo di umidità e inserirla nel forno a 40 ° C per 2 h.</li>
			<li>Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio. Per ogni lavaggio, riempire il piatto di colorazione con 200 mL di tampone di lavaggio 1X e un rack di lavaggio in esso. Toccare il liquido in eccesso in una diapositiva di un tovagliolo di carta alla volta e inserire rapidamente nel rack lavaggio. Muoversi su e giù il portavetrini nel piatto per 3 – 5 volte per 2 minuti a TA.</li>
			<li>Per il secondo lavaggio, utilizzare il tampone di lavaggio fresco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificazione del segnale.<ol>
<li>Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack macchia. Aggiungere 4 gocce di AMP 0 per coprire il tessuto. Mettere la griglia di macchia nella barra di controllo di umidità e inserirlo nel forno per 30 min a 40 ° C.</li>
			<li>Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio, come descritto in precedenza.</li>
			<li>Ripetere questo passaggio con AMP 1 – 6 seguendo l'ordine e la condizione della tabella 2. Lavare i vetrini due volte dopo ogni passaggio di ibridazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rilevamento del segnale<ol>
<li>Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack di macchia. Aggiungere 2 µ l di Fast Red B a 120 µ l di Fast Red (diluizione 1: 60) in un tubo del microcentrifuge. Mescolare bene e aggiungere per coprire completamente la sezione del tessuto. Nota: Il volume totale del rosso A / B mix si basa sul numero e le dimensioni delle sezioni del tessuto. Per una 0,75 '' x 0.75 ' zona, 120 µ l è sufficiente per una sezione. Utilizzare l'impasto entro 5 min ed evitare l'esposizione del mix alla luce diretta del sole o alla luce UV.</li>
			<li>Chiudere il vassoio e incubare per 10 min a RT. Remove la soluzione a un contenitore per rifiuti e immediatamente inserire le diapositive in un rack di lavaggio e mettere la griglia in un piatto di lavaggio riempito con acqua di rubinetto. Risciacquare con acqua fresca di rubinetto.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione di contrasto delle diapositive
	<ol>
<li>Estrarre il cestello di lavaggio da acqua di rubinetto e toccare rapidamente su carta assorbente per togliere l'acqua in eccesso. Inserite la griglia in un 50% ematossilina soluzione di colorazione e immediatamente spostare il rack su e giù più volte. Incubare per 2 minuti a TA.</li>
		<li>Trasferire il portavetrini nuovamente dentro il piatto di acqua del rubinetto. Lavare 3 – 5 volte spostando su e giù il rack e cambiando l'acqua fresca del rubinetto fino a quando le diapositive diventano chiare, mentre i tessuti di cervello rimangono viola.</li>
		<li>Spostare il rack in un recipiente contenente acqua ammoniaca 0,02%. Spostare il rack su e giù 2 – 3 volte fino a quando i tessuti diventano blu. Lavare i vetrini 3 – 5 volte con acqua fresca di rubinetto in un piatto di colorazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaggio dei campioni
	<ol>
<li>Spostare il portavetrini dal piatto di colorazione in un incubatore a 60 ° C ed incubare per almeno 15 min fino a quando le diapositive sono completamente asciutte.</li>
		<li>Posto 40 µ l di soluzione di montaggio sulla diapositiva e attentamente porre un coprivetrino 24 x 50 mm sopra la sezione del tessuto. Aria secche diapositive per 30 minuti a TA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi e raccolta dati
Nota: Utilizzare un scanner per diapositive per la scansione delle immagini a 40 ingrandimenti.
<ol><li>
Controlli positivi e negativi
	<ol>
<li>Per ogni esperimento, includono controlli positivi e negativi (Figura 3). Come un buon controllo positivo, il segnale dovrebbe essere visibile come punctate punti 20-40 ingrandimenti.</li>
		<li>Uso del Mouse (Mm) 1ZZ - PPIB - come controllo positivo. Questa sonda è destinato un comune gene housekeeping PPIB. Per il controllo negativo, un punto per ogni 20 celle visualizzazione sfondo colorazione al campo di 20 X microscopio è accettabile.</li>
		<li>Utilizzare la sonda DapB-1ZZ come controllo negativo. Questa sonda è destinato il gene batterico dapB. Queste sonde di controllo sono state utilizzate in molti ISH saggi19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rilevamento del segnale e l'analisi di come i modelli di espressione di Nf1 esone 23a
	<ol>
<li>Come i segnali di ibridazione sono indicati come puntini punctate, contare i puntini manualmente. Il numero di punti è correlato con il livello delle trascrizioni che viene rilevato da una sonda specifica. Si noti che il numero di punti possa anche essere analizzato dal software di ImageJ o SpotStudio.</li>
		<li>Utilizzare tre sonde per ibridare ad esone 23a-contenenti, esone 23a-carente isoforme o trascrizioni di Nf1 totale (Figura 2). Le tre sonde non possono essere utilizzati contemporaneamente, è possibile utilizzare tre sezioni di tessuto cerebrale adiacente per ibridare ad ogni sonda.<ol>
<li>Per calcolare la percentuale impiombato in (PSI) per esone 23a, contare il numero di cellule e puntini in parecchie regioni del cervello. Per ogni area di interesse, contano più di 400 celle da diverse sub-regioni come indicato nella Figura 4.</li>
			<li>Raccogliere dati dalla stesse sub-regioni per ognuna delle tre sonde. Calcolare PSI come numero di punti per cella con la sonda di inclusione dell'esone 23a / (numero di punti per cella con la sonda l'inclusione dell'esone 23a + numero del puntino per cella con la exon23a saltando sonda) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras/ERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li><li>Zhou, H. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La presente comunicazione illustra l'uso di BaseScope RNA ISH per esaminare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. È dimostrato che giunzione esone-esone anti-senso sonde inferiore 50 nucleotidi possono indirizzare l'inclusione dell'esone e saltando le isoforme robustamente e specificamente. Inoltre, i segnali risultanti possono essere utilizzati per calcolare PSI di un esone alternativo.
Alcune variazioni sono state testate nella procedura. Ad esempio, sezioni di te...

Splicing alternativo (AS) è un processo comune che si verifica durante la maturazione del pre-mRNA. In questo processo, un esone possa essere incluse differenzialmente nel mRNA maturo. Così, attraverso AS, un gene può generare molti mRNA che codificano per prodotti proteici differenti. Si stima che 92 – 94% dei geni umani sottoposti a1,d'impionbatura alternativa2. Modelli di splicing alternativo che anormale è derivato da mutazioni genetiche sono state collegate a un gran numero di malattie, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, la distrofia miotonica e cancro3,4. È dunque fondamentale per studiare e comprendere meglio i meccanismi regolatori d'impionbatura alternative nel tentativo di trovare nuovi trattamenti delle malattie umane.
COME spesso è regolata in modo specifico del tipo di cella. È importante determinare il pattern di espressione AS di un gene specifico in un determinato sistema biologico. Tuttavia, questo diventa complicato quando un organo complesso che contiene molti tipi diversi di cellule, come il cervello o del cuore, è studiato. In questo caso, la scelta ideale del sistema di dosaggio è RNA in situ ibridazione (ISH usando il tessuto) sezioni così il modello di espressione AS di un gene specifico può essere rilevato in molti tipi cellulari contemporaneamente. Infatti, sonde essone-specific sono stati utilizzati per valutare i livelli di espressione di un'alternativa dell'essone5,6,7. Tuttavia, questo approccio non è adatto come analisi di modelli per i seguenti motivi. Primi, ISH i metodi convenzionali di solito uso sonde più di 300 bp, mentre la dimensione media degli esoni interni dei vertebrati (non primo o l'ultimo esone) è di 170 nucleotidi8,9. In secondo luogo, quando una sonda essone-specific è utilizzata per esaminare il pattern d'impionbatura di un esone alternativo interno, la sola isoforma di mRNA rilevata dalla sonda è quello che contiene l'esone, mentre l'isoforma di mRNA senza l'esone non può essere rilevato. Così, il calcolo della percentuale impiombata nel rapporto (PSI) dell'esone alternativo è complicato. Inoltre, ISH fluorescenti convenzionali spesso combina ISH con immunostaining, che riduce l'efficienza di rivelazione e la robustezza. Ad esempio, in uno studio che ha analizzato l'indotta da stress splicing isoforma di commutazione dell'acetilcolinesterasi (AChE) mRNA, digossigenina fu incorporata la sonda ISH e rilevato usando l'anticorpo anti-digossigenina. In alternativa, la sonda marcata con biotina è stato rilevato da un coniugato di fosfatasi alcalina/streptavidina e un substrato per la fosfatasi alcalina10. Nessun metodo utilizza qualsiasi strategia di amplificazione per aumentare la sensibilità di rilevazione. Di conseguenza, è difficile da rilevare trascritti di mRNA che sono espressi a livelli bassi. Così, un sistema di dosaggio più semplice e più affidabile di ISH è necessario analizzare come espressione modelli in situ.
BaseScope recentemente è stato sviluppato sulla base della piattaforma di RNAscope, una consolidata e ampiamente usato sistema di dosaggio ISH. Entrambi i sistemi di analisi utilizzano una tecnologia di amplificazione specifica della destinazione che aumenta la sensibilità di rilevazione11,12. Ciò che distingue uno da altro è la lunghezza della sequenza di destinazione, che è più breve 50 nucleotidi per BaseScope e 300 – 1.000 nucleotidi per RNAscope. Così, è possibile per le sonde di progettazione destinati a giunzioni esone-esone per rilevare specifiche isoforme di mRNA alternativi. Nello studio corrente, è stata predisposta una procedura per esaminare come modelli di espressione di neurofibromatosi tipo 1 (Nf1) esone 23a, un esone alternativo ampiamente studiato nel laboratorio stesso13,14,15 , 16 , 17, nelle sezioni del cervello del mouse. I risultati dimostrano che BaseScope è un sistema ideale per studiare i modelli di espressione di Nf1 esone 23a in situ. Come questo sistema di dosaggio può essere adattato per analizzare come i modelli di espressione degli esoni alternativi molti, rappresenta un nuovo e potente strumento negli studi di As.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Splicing alternativo (AS) si verifica in oltre il 90% dei geni umani. Il pattern di espressione di un esone alternativamente impiombato spesso è regolato in modo specifico del tipo di cella. COME espressione di modelli in genere vengono analizzati mediante RT-PCR e RNA-seq utilizzando campioni di RNA isolato da una popolazione di cellule. In situ esame di come modelli di espressione per una particolare struttura biologica può essere effettuato da RNA in situ di ibridazione (ISH) usando le sonde essone-specific. Tuttavia, questo uso particolare di ISH è stato limitato poiché esoni alternativi sono generalmente troppo brevi per la progettazione di sonde essone-specific. In questo rapporto, l'uso di BaseScope, una tecnologia sviluppata di recente che si avvale di corti oligonucleotidi antisenso in RNA ISH, è descritto per analizzare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. Esone 23a di neurofibromatosi di tipo 1 (Nf1) viene utilizzato come esempio per illustrare che sonde di giunzione esone-esone breve mostrano segnali di ibridazione robusto con elevata specificità nell'analisi di RNA ISH su sezioni di cervello di topo. Ancora più importante, i segnali rilevati con sonde specifiche inclusione e saltando essone utilizzabile per calcolare in modo affidabile la percentuale impiombata in valori di Nf1 esone 23a espressione in diverse aree anatomiche di un cervello di topo. Il protocollo sperimentale e metodo di calcolo per analisi sono presentati. I risultati indicano che BaseScope fornisce un nuovo e potente strumento per valutare come espressione modelli in situ.

BaseScope ISH è stata effettuata utilizzando tre diversi ceppi di topi: topi wild type CD1, topi wild type C57BL/6J e Nf123aIN/23aIN topi mutanti in background C57BL/6J, nel quale esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule come conseguenza di engineered della giuntura le mutazioni14,15.
Come primo passo, il sistema di analisi ISH è stato testa...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Universidad San Sebastian

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Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K Views.  Case Western Reserve University. È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

La fusione assoluta e relativa PCR quantitativa dei dati per quantificare STAT3 Splice Variant Trascrizioni

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Ricerca

Genetica

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Ricerca sul cancro

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neuroscienze

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Biologia

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

La fusione assoluta e relativa PCR quantitativa dei dati per quantificare STAT3 Splice Variant Trascrizioni

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in

Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione

La combinazione di doppio Fluorescenza

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections