Name: metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues
Uploaded: 2018-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

R.J.M. bir AMC Doktora Bursu tarafından desteklenir. Bu araştırma Hollanda Kanser Derneği (KWF grant UVA 2014-6839) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr. A. Jonker onun yardımıyla iletişim kuralının yazma için teşekkür ederiz.

Bu iletişim kuralı, akademik tıp merkezi tıbbi etik İnceleme Kurulu insan malzemenin kullanım kuralları izler.
1. hücre ve doku kısımlara hazırlanması
<ol><li>Hücreleri<ol>
<li>10 mm Petri dish olarak 37 ° C'de 5 min için 1 mL % 0.25 tripsin-EDTA kullanarak kültür yemekleri hücrelerden trypsinize ve 50.000-200.000 hücre/mL, hücrelerin büyüklüğüne bağlı olarak bir 37 ° C askıya hücrelerde getir.</li>
		<li>200 µL hücre süspansiyon oda sıcaklığında 5 min için bir cytocentrifuge 20 x g de cytospin hunileri kullanarak mikroskobu slayda ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 24 h için cytospins kuruması. Bu dehidrogenaz aktivitesi etkilemez. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku bölümleri<ol>
<li>Hasta ya da etik izni göre hayvan doku ayıklamak. 10 mm3 doku birden çok deneyler için yeterlidir.</li>
		<li>Doku adet küçük Bacalı 2 mL Plastik tüpler koyun ve ek-sıvı azot doku parçası içeren şişeleri donma.</li>
		<li>Daha fazla işleme kadar doku parçaları −80 ° C de içeren şişeleri saklayın.</li>
		<li>En iyi kesim ısı (OCT) adı verilen bir jel gibi orta su kristalleri oluşamıyor donuyor-20 ° C-25 ° C aşağı hızla, bir ayna üzerinde doku örneği bağlarsınız için kullanın.</li>
		<li>Kesme ve ilk istenen seviyeye blok döşeme için bir cryostat kullanın (ideal bir mikroskobu yarım genişlik cam slayt, Örneğin 5 x 5 mm).</li>
		<li>Kesit üzerine, fırçalar ve bir anti-rulo levha bölümleri yukarı doğru kıvrık engellemek için kullanın.</li>
		<li>Yavaş ama sabit bir hızda 6-10 µm kalınlığında bölümlere doku örneği kesme (1 s bölüm başına). Bir bölümü doğru kestiğinizde, düz microtome bıçak altına anti-roll plaka üzerinde kalır.</li>
		<li>1-3 bölümleri microscopical cam slaytlara almak ve −80 ° C kullanmak kadar saklamak. Hazırlanan bölüm sayısı doku örneğinin boyutu ve bölümlerin istediğiniz kalınlıkta bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enzim Histo/Cytochemistry çözünür Dehydrogenases için
<ol><li>Reaksiyon arabellek hazırlanıyor.<ol>
<li>Fosfat tampon doğru pH 100 mL hazırlamak (bkz. Tablo 1; her enzim hangi faaliyete en yüksek değildir bir optimum pH vardır). Örneğin, mix çözümleri 0.1 M KH2PO4 (asidik) ve 0.1 M NA2HPO4 (temel) bir arabellek doğru pH ile yapılır kadar.</li>
		<li>PVA tozlu ve zehirli olduğu gibi içine bir duman başlık altında fosfat tampon Polivinil alkol (PVA) 18 g tartmak.<ol>
<li>% 18 w/v PVA 100 ° C'de fosfat tampon tampon ısınma tarafından çözülür au bain marie (cam şişe kaynar suda koymak) ve PVA tamamen eriyene kadar karıştırarak. Çözüm sonra saydam karıştırma tarafından neden olduğu küçük hava kabarcıkları ile olabilir. Genellikle ~ 15dk çözülmeye PVA gerektirir. Not: % 18 w/v PVA fosfat tampon viskoz ve geniş bir pipet kullanarak 15 mL tepki arabellek tüpler için transfer edilebilir. % 18 w/v PVA fosfat tampon kısa süreli depolama ortaya ≥40 ° C ve uzun süreli depolama (2 hafta) ≥ 60 ° c 500 µL bir doku bölümü için gerekli olmakla birlikte 250 µL % 18 w/v PVA fosfat tampon cytospin hazırlık için genellikle gereklidir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tetrazolium tuz (nitroBT) çözüm hazırlamak. Kuluçka orta her 1 mL için 40 µL nitroBT çözüm, 5 mg nitroBT (sarı tozu) 20 µL dimethylformamide (DMF) karışımı içinde çözünmüş oluşan gereklidir ve 20 µL etanol, bir ışık sarı şeffaf çözüm olacaktır. Not: nitroBT kararlılığını tüm gerekli reaktifler en düşük olduğu için bu son nitroBT hisse senedi çözüm hazırlamak ve nitroBT ilk tepki orta dağıtılması önerilir.<ol>
<li>DMF ve etanol nitroBT kısa bir süre sırasında cam şişede Isıtma tarafından çözülür (~ 10 s) Bunsen burner kullanarak. Isıtma sırasında şişeyi sallayın ve buharlaşma önlemek için çok uzun alev şişede bırakmayın.</li>
			<li>% 10 yapmak DMF ve etanol buharlaşma eriterek işlemi sırasında izin vermek için ilave nitroBT çözüm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elektron taşıyıcıları phenazine methosulfate (PMS) veya (1-metoksi) kalkan-Cam depolama şişe folyo sarma tarafından doğrudan ışık m(PMS) içeren phenazine methosulfate (MPM) ve kuluçka medya.</li>
		<li>Tablo 1 göre reaktif çözümler distile H2' O. çözülerek hazırlamak Bazı reaktifler hızla yok, onları mümkün olduğunca deneme olarak kısa bir süre önce hazır olun. Kadar kullanmak reaktif çözümler 4 ° C veya buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Tablo 1 ' de gösterildiği gibi kuluçka ortam hazırlamak ve çözüm her adımdan sonra nazik karıştırma tarafından lunaparkçı. Sürekli karıştırmaya ve spatula karıştırma sırasında kuluçka ortamının yüzeyinin altında tutmak tarafından hava kabarcıkları kuluçka orta nesil kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuluçka orta doku bölümlerine uygulama<ol>
<li>Önceden sıcak mikroskobu slaytlar ile cytospins veya 15 dakika süreyle bir immünhistokimya kuluçka odasında 37 ° C'de bağlı doku bölümleri daldırın immünhistokimya kuluçka odası sabit bir sıcaklık sürdürmek için sıcak su ile alt Kuluçka makinesi.</li>
		<li>Dikkatle break ya Pasteur Pipetler, geniş kısım dar geçiş kapalı gördüm. Düzenli Pasteur pipetler Pasteur pipetler kuluçka orta aspirasyon için yeterince geniş yapmak için bu adım gerekli değildir viskoz kuluçka orta Aspire edin çok dardır.</li>
		<li>250-500 µL uygun kuluçka orta her hücre hazırlık veya doku bölüm Pasteur pipet geniş parçası kullanarak mikroskobu slaytlara uygulanır.</li>
		<li>Pipet Ucu kuluçka orta eşit şekilde yaymak için kullanın. Çünkü bunlar yüzeye yüzer olacak ve enzimatik reaksiyon mikroskobu slayt hücre hazırlık veya doku kısmında engel olmayacak küçük hava kabarcıkları kuluçka orta dikkate almayın.</li>
		<li>Hücre hazırlıklar veya doku Bölüm 37 ° C kuluçka (Örneğin bir doku kültürü kuluçka) mikroskopi slaytlarda enzim kinetiği ve onun ifade belirli hücre hazırlanmasında bağlı olarak önceden belirlenmiş bir süre için kuluçkaya veya doku (Tablo 1). Ağzını immünhistokimya kuluçka odası tepki arabellek kurumasını önlemek için nemli bir ortam sağlamak için kapalı tut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopi slaytlar yıkama<ol>
<li>Bir doku medyada fazla kuluçka kapalı dokunun.</li>
		<li>Mekanik olarak 60 ° C fosfat tampon mikroskobu slaytlar arabellekte yukarı ve aşağı hareket ettirerek pH 5.3, mikroskobu slaytlardan kuluçka orta durulayın. Bu enzimatik reaksiyon durdurur.</li>
		<li>Mikroskopi slaytlar 60 ° C fosfat tampon pH 5.3 20 dk tutarak yıkayın.</li>
		<li>Mekanik mikroskobu slaytlar 60 ° C dokunun suda yıkayın.</li>
		<li>Mikroskopi slaytlar için 20 dk 60 ° C musluk suyundaki tutarak yıkayın.</li>
		<li>Su ve yavaş yavaş 1 dakika boyunca oda sıcaklığında musluk suyu 60 ° C musluk suyu ile karıştırılarak slaytlar sakin olun.</li>
		<li>Oda sıcaklığında distile suda son mekanik çamaşır adımıysa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lekeli Cytospins veya doku bölümleri mikroskobu slaytlarda alın<ol>
<li>Önceden bir slayt 50-60 ° C'de daha sıcak sıcak</li>
		<li>Dikkatli bir kağıt havlu kullanarak mikroskobu slaytların arka tarafını kuru ve slayt üzerinde mikroskobu slayt üst kısmında kuru sıcak koyun.</li>
		<li>Slaytları kuru olduğunda, hücre hazırlıklar veya doku bölümleri mikroskobu slaytlarda gliserol jöle montaj orta ve coverslips kullanarak alın.</li>
		<li>Hemen resim alma ile devam veya hücre hazırlıklar veya doku bölümleri mikroskobu slaytlar bir buzdolabı 4 ° C'de karanlıkta kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. resim alma
<ol><li>Sabit yeterli dinamik alan (en az 8-bit ama tercihen 10 bit veya 12-bit), bilimsel tek renkli CCD kamerayla kayıt görüntülerle kazanç ve doğrusal bir yanıt.</li>
	<li>(20 X-63 X cytospins için) ve 10-63 X doku bölümleri için uygun bir hedefi seçin.</li>
	<li>Böylece biraz görüş alanı daha büyük alan diyafram daraltarak parlamayı azaltmak.</li>
	<li>Kullanım isobestic dalga boyu bir kızılötesi engelleme ile birlikte formazan acele7 yakınındaki 10 nm geniş bant kesmesi filtre uygulayarak monokromatik ışık filtre ( Malzeme tabloyabakın). Not: NitroBT maksimum isobestic absorbans 585 olduğunu nm.</li>
	<li>Aydınlatma kamera tüm gri düzeyi aralığını kullanıldığından emin olmak için en iyi duruma getirme (Yani, seviyesinin aydınlatma böylece maksimum aydınlatma boş mikroskop slayt kaydederken aşırı maruz kalmadan elde edilir).</li>
	<li>Bilinen absorbans (veya optik yoğunluk [OD]) ölçülen gri düzeyleri değerleri ayarlama. Bu amaçla, en az 10 farklı adımları bir kalibrasyon slayt veya adım yakalama gri ölçek görüntüleri her iki piyasada bulunan (bkz: Malzemeler tablo) (bkz: adım 4.1.1) bilinen OD değerleri ile tablet veya tarafından özel yapım gri ölçek kama adım tablet ölçmek bir gri değerleri bilinen absorbans değerleri için densitophotometer ve ölçülebilir sonuçları ayarlamak için kullanın.</li>
	<li>Photomicrographs hücre ve doku kısımlara ilgi yakalama.</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Önce görüntü analizi, ImageJ yazılım absorbans ölçümleri için kalibre.<ol>
<li>Photomicrographs bilinen absorbans parametreleri bilinen OD değerleri ile kalibrasyon slayt veya adım tablet ile en az 10 kalibrasyon alanların absorbans (OD) ölçmek. ImageJ içinde seçili bir alanı ölçmek için analiz → ölçü menüsünü veya Ctrl + M hotkey kullanın.</li>
		<li>Absorbans kalibrasyon prosedürü Çözümle'giderek başlatın → kalibrasyon. Eleman işlevi "Rodbard (NIH İmaj)". Açılır pencerenin sol sütunda 4.1.1 içinde gerçekleştirilen kalibrasyon slayt/adım tablet her adım gri seviye ölçüm sonuçlarını zaten var. Eğer değilse, bunları ImageJ sonuçları ekranından kopyalayın. Sağ sütunda, kalibre adım tablet ile alınan sertifika üzerinde yazılı olarak ilgili her bilinen absorbans değeri girin. Onay kutuları "küresel kalibrasyon" ve "Gösteri komplo" ve "OK" tuşuna basın.</li>
		<li>Kalite kontrol için Rodbard işlevinin R2 olduğundan emin olun > 0,99. O ise < 0,99, kalibrasyon slaytlar ve fotoğrafı doğru ölçülen ve bilinen absorbans parametreleri doğru girilmiş kontrol edin.</li>
		<li>ImageJ siz programı kapatıncaya kadar şimdi kalibre (dolayısıyla "Küresel kalibrasyon"). Absorbans ölçümleri, bir kalibre edilmiş ImageJ oturum her zaman gözlenen absorbans değerleri 0 ile 1 arasında nerede 0 anlamına gelir dönüştürür ve 1 sıfır Asimtotlar bulunur ve absorbans, sırasıyla tam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytospins için Seç > rasgele bir şekilde 100 tek hücre. Doku bölümleri için bir veya daha fazla alan bir sabit uzunluk ve genişlik ilgi tüm bölümleri seçin.<ol>
<li>Projeyi bir ızgara üzerinde tarafsız hücre seçimleri yardımcı olmak için photomicrographs. ImageJ içinde bir kılavuz eklentileri → analiz → kılavuz menüsü üzerinden bir görüntü üzerinde proje.</li>
		<li>ImageJ, tek hücreleri seçmek için eliptik aracını kullanın ve doku bölgeleri seçmek için Dikdörtgen aracını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seçili hücreleri ya da doku bölgeleri ve absorbans ölçmek. Optik yoğunluk ve alan "Demek" adı verilir ve ImageJ "alanında" elektronik tablo, sırasıyla sonuçlanır. Not: (Birden fazla doku bölge farklı boyutları ile seçtiyseniz) bir hücre veya doku bölgesinde toplam absorbans tüm ayrılmış piksel absorbances toplamı eşittir. Bir hücre 1000 piksel görüntüsü, toplam absorbans 1000 absorbances toplamı tarafından verilir ve ortalama absorbans toplam absorbans/1000 tarafından verilir. Bu yordamı ayrıca dağılımsal hata önler.</li>
	<li>Ortalama toplam absorbans, belirlemek > 30 hücreleri veya kuluçka orta substrat ama Kofaktörler varlığında yokluğunda denetlemek için maruz kalmış bir örnek içeren denetim slaytları bölgelerden doku. Bu denetim absorbans denetlemek için non-spesifik enzim aktivitesi boyama için kullanılan ve absorbans eserler orta, kapak notu veya mikroskop montaj kullanılan mikroskobu slayt tarafından indüklenen.</li>
	<li>Tüm toplam absorbans ölçümleri kofaktör (substrat ve/veya inhibitörü farklı konsantrasyonları) ama aynı konsantrasyonu ile kuluçka orta sinin örnekleri üzerinden ortalama denetim absorbans çıkarma. Bu bir hücre veya doku bölgesinde düzeltilmiş toplam absorbans verir.</li>
	<li>İstatistiksel ortalama düzeltilmiş toplam absorbances öğrenci T-testi veya deneysel tasarım bağlı olarak tek yönlü ANOVA testi kullanarak karşılaştırın.</li>
	<li>Formazan absorbans dönüştürülmüş enzim aktivitesi (µmol dönüştürülmüş substrat mL başına min başına) kullanarak içine Lambert-bira Kanunu: c=A/(є×d), c formazan reaksiyon orta yoğunlukta nerede, A ImageJ içinde ölçülen absorbans sonra kalibrasyon; Є olduğunu formazan tükenme katsayısı (16.000 585 nm)8 ve d olduğunu seyahat ortalama hücre kalınlığı veya nominal bölüm kesme kalınlığı (6-10 µm bu protokolü) eşittir mesafesi ışık. Not: kuruduktan sonra doku bölümü kalınlığı ~ %50 nominal bölüm kesme kalınlığı azaltır, ancak nominal bölüm kesme kalınlığı biyolojik olarak en alakalı olduğundan bu hesaplamadaki yansıtılmaz. Ortalama hücre kalınlığı ve cep mikroskobu cam slaytlara preparatlar yapıştırılır küre boyutlarının confocal mikroskopi veya kendisi için protokolleri başka bir yerde bulunabilir geniş alanlı mikroskobu kullanılarak belirlenebilir. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+enzymes+at+work:+metabolic+mapping+by+enzyme+histochemistry.">Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).</li><li>Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry:+protocols+for+2D+and+3D+quantification+in+microscopic+images.">Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images.</a> Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytophotometry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+cells.">Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells.</a> Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).</li><li>Butcher, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+in+tissue+sections+of+the+two+formazans+derived+from+nitroblue+tetrazolium+in+dehydrogenase+reactions.">The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions.</a> Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).</li><li>Matsumoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).</li><li>Errington, R. J., White, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamic+cell+volume+in+situ+by+confocal+microscopy.">Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).</li><li>Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driver+and+passenger+effects+of+isocitrate+dehydrogenase+1+and+2+mutations+in+oncogenesis+and+survival+prolongation.">The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).</li><li>Molenaar, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotection+of+IDH1-Mutated+Cancer+Cells+by+the+IDH1-Mutant+Inhibitor+AGI-5198.">Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198.</a> Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).</li><li>Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+gene+expression+analysis+reveals+glycolysis+and+acetate+anaplerosis+in+IDH1+wild-type+glioma+and+lactate+and+glutamate+anaplerosis+in+IDH1-mutated+glioma.">In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma.</a> Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).</li><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Webb, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).</li><li>Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phosphate-activated+Glutaminase+Activity+and+Its+Kinetics+in+Mouse+Tissues+using+Metabolic+Mapping+(Quantitative+Enzyme+Histochemistry).">Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry).</a> J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).</li><li>van Lith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+as+chemotactic+fuel+for+diffuse+glioma+cells:+are+they+glutamate+suckers?.">Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çünkü araştırmacılar metabolik etkileri patogenez ve birçok hastalığın tedavisi için çok önemli olduğunu fark hücresel metabolizma üzerinde araştırma Şu anda bir Rönesans yaşıyor. 1 Ayrıca, metabolik araştırma kütle spektrometresi ve manyetik nükleer rezonans konularına spektrometresi radioisotopic etiketleme de dahil olmak üzere araştırma zamankinden daha araçları ile bu alanı sağlamak teknikleri bir artan kullanılabilirlik tarafından destekli. Metabolik eşleme yoluyla roman bir tekniktir, ancak kapasitesini neredeyse gerçek doğa durumda enzimlerin faaliyeti entegre bilgi vermek için bu tekniği daha alakalı her zamankinden daha yapar. 2
Kofaktör+ NAD ve NADP+ dehydrogenases çok erken evrimi sırasında ortaya çıkan gösterir tüm canlı hücreler bulunur ve hücresel metabolizmasında önemli rollere sahip. 14 , 15 Şu anda dehydrogenases sınıflandırılır ve tüm türler arasında meydana 523 enzim katalize reaksiyonları vardır. 16 teorik olarak, tüm farklı dehidrogenaz reaksiyonlar etkinlik ayrı olarak burada açıklanan metabolik eşleme iletişim kuralı tweaking tarafından araştırılması. Her enzimatik reaksiyon substrat ve faaliyet için gerekli olan Kofaktörler benzersizdir. Bu nedenle, her enzimatik reaksiyon etkinliği yeterli substrat ve Kofaktörler tepki orta ile bir metabolik eşleme deneyi kullanarak belirlenebilir. Ancak, bazı enzim izoformlarının onların hücre altı yerelleştirme farklı, başka bir izoformu mitokondri içinde işlevleri ise Örneğin bir izoformu bir tepki sitoplazmada tromboksan. IDH1 ve IDH2, eski sitoplazmik olduğu dikkate değer bir örnektir ve ikinci mitokondrial ve hangi iki farklı protein iki farklı genler tarafından kodlanmış. 11 1-metoksi-5-methylphenazinium methylsulfate (metoksi-PMS) ve 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) her ikisi de elektron taşıyıcı olarak bu deneyler için kullanılabilir. Eski mitokondrial membranlar, ikinci does değil geçmek. Bu nedenle, sitozolik enzimler (Örneğin IDH1) üzerine araştırmalar MPM'ler kullanmanız gerekir Oysa mitokondriyal enzimlerin (Örneğin IDH2) üzerine araştırmalar PMS kullanmanız gerekir.
Birçok teknikleri olduğu gibi varyasyonları tetrazolium tuzları, farklı türleri kullanarak gibi bu protokol, PMS ilavesi hariç ve sodyum azid bir sulu montaj orta kullanarak ve kuluçka değişen ve kez, durulama, var olmayan ve eşit derecede iyi çalışabilir. Tetrazolium tuzları ile metabolik eşleme uygulanması için dehydrogenases sınırlı değildir. Protokol için küçük değişiklikler ile de doğrudan işlev enzim etkinliği değerlendirmesi için kullanılabilmesi için bir dehidrogenaz metabolik yolu içinde ters yönde. Bu ilke glutaminase enzim, doğrudan işlevleri17 için daha önce açıkladığımız glutamat dehidrojenaz glutaminolysis yolu içinde ters yönde. 18 teorik olarak, işlev doğrudan aşağı akım veya doğrudan ters yönde IDH2 ve IDH3 tricarboxylic asit (TCA) yatıyor bir dehidrogenaz Örneğin aconitase, ters yönde geçiş yapmak diğer enzimler aynı prensip uygulanabilir. Başka bir basit tablo 1'de açıklanan konsantrasyonu substrat, kofaktör ve/veya engelleyici çeşitli konsantrasyonları ile kuluçka orta şişeleri yapma yoluyla çeşididir. Bu doz-etkinlik eğrileri üretimi konsantrasyonu substrat, kofaktör ve/veya inhibisyon bir fonksiyonu olarak sağlar.
Araştırmacılar substrat ve kofaktör düzeyleri yansıtmıyor olabilir substrat ve kofaktör konsantrasyon seçmek zorundasınız çünkü teknik olarak konuşan, metabolik eşleme deneyler in situ enzim aktivitesinin tarafsız gözlem kolaylaştırmak değil Mevcut in situvardır. Ayrıca, viskoz PVA tepki orta oluştururlar, yerinde ve biçimsel korumak için hizmet vermektedir ama etkili difüzyon tepki orta aracılığıyla düşük molekül ağırlıklı reaktifler ve yasaklar % 18 kullanımı. 3 , 5 bu nedenle, supraphysiological substrat konsantrasyonu kullanın, burada açıklanan deneyler kararlı enzim faaliyetlerine verilen substrat konsantrasyonu vivo içinde durum ama için uygun yansıtmıyor intra deneysel karşılaştırmalar. Böylece, metabolik eşleme deneyler sonucu mevcut içinde in situsubstrat ve kofaktör düzeyleri bağlamında enzimatik reaksiyon üretim kapasitesi (maksimum etkinlik) olduğunu. Ayrıca, hücre hazırlıkları tarafsız karşılaştırma en fazla üretim kapasitesi (Vmax) ve bir substrat/kofaktör benzeşim (Km) bir enzim substrat ve/veya kofaktör çeşitli konsantrasyonları ve birden fazla örnekleri kullanımına izin verir , dokular veya doku bölgeleri. Bu parametreler enzim protein ifade, translasyonel modifikasyonlar ve kalabalık bir microenvironment etkisi enzim aktivitesinin toplamı sonucu oluşur. Bu nedenle, metabolik eşleme hala bir daha iyi enzim aktivitesinin protein ifadesini belirleyin veya enzim aktivitesi vitrosaf deneyleri daha yansımasıdır.

Bir temel Hücresel Fizyoloji metabolizma taşıdır. Metabolizma hücreleri tüm fizyolojik işlemleri için gerekli enerji sağlar, makromoleküllerin biyosentezi için yapı taşları sağlar ve hücresel homeostazı atık ürünlerin, toksik molekülleri ve parçalara ayırma ile ilgili olarak düzenler ve gereksiz ya da işlevsel olmayan hücresel bileşenleri geri dönüşüm. Enzimler neredeyse tüm önemli hücresel kimyasal reaksiyonları katalize ve bu nedenle hücre fizyolojisi motor üniteleri. 1 , 2
Enzim aktivitesinin sıkıca birçok düzeylerinde düzenlenir ve bu nedenle nicel enzim histochemistry ve cytochemistry (metabolik eşleme olarak da bilinir) enzim aktivitesi içinde in situçalışmak için tercih edilen yöntem. Transkripsiyon düzeyinde gen ekspresyonu mRNA halinde düzenlenmiştir. Transkripsiyon etkisini kantitatif mRNA deneyleri, microarrays veya doğrudan RNA sıralama veya in-situ hibridizasyon (alt) hücresel hakkında bilgi veren gibi nitel mRNA deneyleri gibi kullanarak belirlenebilir Yerelleştirme mRNA molekülleri. Bu hücreler arasında transkripsiyon faaliyet göreceli farklılıklar takdir sağlar. Ancak, bu mRNA deneyleri metabolik aktivite ile ilgili olarak geçerliliği ve yorumu karmaşık yönetmelik Ayrıca DNA transkripsiyonu sonra nerede mRNA molekülleri kararlılığını ve sıra düzenlenmiş mRNA düzeyinde gerçekleştiği için. Bu düzenleme protein izoformu çeviri ve ribozom, protein çeviri miktar düzenlemektedir. Buna ek olarak, protein çeviri süreci kontrol edilir ve sonuçta enzim ifade ve bu nedenle faaliyet etkiler. Yukarıda belirtilen yasal adımları kombine etkileri Western blot ters faz protein lysate microarrays veya gibi nitel protein ifade deneyleri, nicel protein ifade deneyleri gibi kullanarak takdir edilebilir immunocytochemistry ve immünhistokimya, ancak bu teknikler gibi proteinlerin translasyonel modifikasyon ve işlevsel düzenleme kalabalık onların microenvironment enzimler, aşağı akım düzenleyici etkileri dahil etmek başarısız. Ayrıca, böylece saf bir enzim hücre veya doku homogenates veya seyreltilmiş çözümleri aktivitesi ölçümleri enzim aktivite çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir enzim ifade kötü onun aktivite ile ilişkilendirmek. Ancak, bu deneylerin bir enzim aktivitesinin etkisi bir kalabalık compartmentalized sitoplazma veya organel çoğaltmak başarısız. Ayrıca, tüm yukarıda belirtilen teknikler mRNA veya enzim ifade lokalizasyonu veya miktar belirler, ancak bu entegrasyonu bırak, enzim ifade her iki bu yönleriyle kapsamlı bilgi vermek mümkün enzim aktivite tayini ile bilgi. 2 , 3 , 4
Metabolik eşleme bir enzim etkinliğini belirlemek söz konusu değişkenleri takdir sağlar. Dahası, metabolik eşleme canlı hücre veya hücreleri ve enzim aktivitesinin verileri oluşturmak için bir neredeyse gerçek doğa durum oluşturmak için Çözümleme sırasında olduğu gibi tutulur dokular ile doku görüntülemede bir şeklidir. Enzim aktivitesi konumunu hem de bir hücre veya doku bölme içinde enzim aktivitesinin sağlam miktar detaylı takdir kolaylaştırmak görüntüleri üretir. 3 , 4 laboratuvar kılavuzun ilkelerine nicel enzim histochemistry,6 ve üzerinde5 mevcut enzim histochemical yöntemlerinin, burada dehydrogenases aktivitesinin metabolik eşlemesi için açıklanan protokolleri temel alır görüntü analizi nicel metabolik haritalama. 4
Dehydrogenases NAD+, NADP+ ve FAD gibi kurallı Kofaktörler NADH, NADPH ve FADH2, sırasıyla azaltmak için redoks tepkimeleri gerçekleştiren enzimlerdir. Sağlam hücreleri veya kimyasal olarak sabit değildir cryostat doku bölümler içeren, diğer reaktifler, substrat ve Kofaktörler belirli bir dehidrogenaz ve tetrazolium tuz arasında bir reaksiyon ortamda inkübe. Daha sonra o dehidrogenaz katalitik faaliyet gerçekleştirir ve, örneğin, NADP+ NADPH için azaltır. Bir elektron taşıyıcı ile 2 NADPH molekülleri sonuçta hemen dehidrogenaz sitesinde precipitates 1 su çözünmez mavi formazan molekül içine 1 suda çözünen yarı renksiz tetrazolium tuz molekül azaltmak. Bu nedenle, zarlarını formazan absorbans doğrudan bir dehidrogenaz yerel etkinlik ölçüsüdür ve ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir veya monokromatik ışık mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Bu iletişim kuralı niceliksel yönüyle araştırmacılar bu deneyleri istatistiki sonuçlara ulaşmak sağlar. Buna ek olarak, bu miktar maksimal enzim aktivitesi (Vmax) ve bir substrat benzeşimi için bir enzim (Km) gibi in situ kinetik enzim parametreleri belirlenmesi kolaylaştırır. 3 , 4 , 5 , 6
Metabolik eşleme deney planlarken, bu deney en fazla elli cam slaytlar yapışan hücre hazırlıklar veya doku bölümleri ile are salık vermek o zaman gecikmeleri tutarlı elde etmek için kuluçka sırasında en aza indirmek için gerçekleştirmek önemlidir sonuçlar. İletişim kuralı adımları işbirliği tarafından birden fazla deneyci yapılır ne zaman daha fazla slaytlar ve/veya orta besteleri işlemek mümkündür. Ayrıca, bazı değişkenlik deneyler arasında bulunmaktadır. Bu nedenle, aynı deneyler cytospins her hücre hazırlık üzerinden veya bölümleri her doku örneği üzerinden ile en az 3 kez yinelenmelidir ve uygun denetimleri her deneyde dahil edilmelidir. Her zaman bir denetim kuluçka orta substrat ama kontrole kofaktör varlığında yokluğunda non-spesifik enzim aktivitesi boyama için hazır olun. Böylece deneyci analizleri kinetik enzim kullanarak gerçekleştirebilir en iyi temsil eden sonuçları farklı yüzey/kofaktör konsantrasyonlarda doku bölümleri veya hücre hazırlıkları için aynı örnekten uygulandığı deneylerde alınır doz-etkinlik eğrileri.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate (NA&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck Millipore</td><td>106559</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium succinate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W327700</td><td></td></tr><tr><td>DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1252&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2300</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GG1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Lithium 6-phospho-D-galactonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55962</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>methoxy-Phenazine methosulfate</td><td>Serva</td><td>28966.01</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adenine dinucleotide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0505&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NADP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methosulfate</td><td>Serva</td><td>32030.01</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1763</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck Millipore</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium L-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter</td><td>Edmund optics</td><td></td><td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td></tr><tr><td>Grey-step wedge</td><td>Stouffer Industries</td><td></td><td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td></tr></tbody></table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

Değiştirilmiş hücresel metabolizma birçok hastalıkları, kanser, kalp-damar hastalıkları ve enfeksiyon gibi bir özelliğidir. Metabolik motor üniteleri hücre enzimlerdir ve faaliyetlerini ağır düzenlenmiştir birçok düzeyleri, transkripsiyon da dahil olmak üzere, mRNA kararlılığı, çevirim, translasyon ve işlevsel düzeyi. Bu karmaşık yönetmelik kantitatif mRNA deneyler, Western engelliyor ve immünhistokimya, gibi geleneksel nicel veya görüntüleme deneyleri enzimler, işlevlerine son etkinliği ile ilgili eksik bilgi verim anlamına gelir ve/veya onların hücre altı yerelleştirme. Nicel enzim cytochemistry ve histochemistry (Yani, metabolik eşleştirme) in situ enzimatik aktivite ve kinetik, fonksiyon ve bir neredeyse gerçek doğa durumda hücre altı yerelleştirme üzerine ayrıntılı bilgi göster.
Biz kofaktör NAD(P)+ ve FAD gibi azaltmak için redoks tepkimeleri gerçekleştiren enzimlerdir dehydrogenases bir etkinlik tespit için bir protokol tanımlamak. Hücre ve doku bölümleri bir dehidrogenaz enzim aktivitesi için belirli bir ortamda inkübe. Daha sonra soruşturma konusu dehidrogenaz enzim faaliyete hücre altı sitesinde gerçekleştirir. Bir kimyasal reaksiyon reaksiyon orta ile bu sonuçta mavi renkli formazan dehidrogenaz'ın faaliyet alanında oluşturur. Formazan'ın absorbans bu nedenle dehidrogenaz'ın faaliyet doğrudan bir ölçüsüdür ve monokromatik ışık mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Bu iletişim kuralı niceliksel yönüyle araştırmacılar bu deneyleri istatistiki sonuçlara ulaşmak sağlar.
Gözlemsel çalışmaların yanı sıra belirli enzim inhibisyonu çalışmaları için bu tekniği kullanabilirsiniz. Bu bağlamda, metabolik eşlemesi, gerçek doğa avantajları yararına çalışmalar in situ sonuçlar veren fizyolojik olarak daha vitro enzim inhibisyonu çalışmalar daha alakalı olabilir. Toplamda, metabolik eşleme metabolizma cep veya doku düzeyinde eğitim için bir vazgeçilmez tekniğidir. Teknik kabul etmek kolaydır, ayrıntılı, kapsamlı ve tümleşik metabolik bilgi sağlar ve hızlı kantitatif analiz sağlar.

Kuluçka orta hazırlamak için birkaç protokol belirli bir dehidrogenaz aktivitesinin araştırmak için gösterilir. Her dehidrogenaz PVA çözümde listelenen reaktifleri az 37 ° c sıcaklık koruyarak dağıtılması Reaktifler tabloda listelenen sırada çözünmüş, yani nitroBT her zaman ilk tasfiye edilir ve (m) PMS her zaman son tasfiye edilir. NitroBT her 5 mg 40 µL karışımda (20 µL etanol + 20 µL dimethylformamide) feshedilmiştir. 1 mL ~ 2 doku bölümleri veya ~ 4 hücre hazırlıklar cam slaytlara leke için kullanılan % 18 PVA çözeltisi başı tüm birimleri bulunmaktadır. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP ve substrat çözümleri taze yapılmalıdır. NaN3, MgCl2 ve (m) PMS çözümleri için bir ay 4 ° C'de saklanabilir. % 18 PVA çözünmüş fosfat tampon 60 ° C'de 2 hafta boyunca saklanabilir. % 18 PVA çözüm pH 0,1 M potasyum dihydrogen fosfat (KH2PO4) ve 0.1 M disodyum hidrojen fosfat (NA2HPO4) arabellekleri farklı kompozisyonlar kullanılarak ayarlanabilir. Gösterilen kuluçka dönemleri iyi başlangıç noktası sunan, ama bu tür, doku türü ve doku korunması en uygun kuluçka dönemleri bağlıdır. Genel olarak, hücre hazırlıklar formazan üretim benzer bir düzeyde elde etmek için doku bölümleri daha uzun inkübe.
Vahşi tipli isocitrate dehidrogenaz 1 ve 2 (IDH1/2) sırasıyla NADP+ NADPH için eşlik eden azaltma sitoplazma ve mitokondri, α-ketoglutarate (αKG) isocitrate dönüşümünü katalize. Bu enzimler insan kanser, birincil beyin kanseri (glioblastoma) ve kolorektal kanser de dahil olmak üzere çeşitli türleri IDH1/2 mutasyonlar meydana çünkü son zamanlarda ilgi çekmiştir ve olanaklarını göstermek için benzersiz bir fırsat sunuyoruz metabolik eşleme. IDH1 mutasyonlar IDH1 vahşi tipi enzim aktivitesi devre dışı bırakıp da üretim ve oncometabolite D-2 sonraki birikimine yol açar bir neo-enzimatik aktivite teşvik-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 olan başka bir yerde ayrıntılı olarak ele. 12 metabolik eşleme deneyler gösterdi o NADP+-bağımlı IDH1/2 etkinlik önemli ölçüde daha düşük bir-knocked in Heterozigoz IDH1 mutasyon olduğunu kolorektal karsinom hücre ile kolorektal karsinom hücrelerdeki IDH1 vahşi-tipi (Şekil 1A). Bu fark monokromatik ışık photomicrographs (Şekil 1B) görüntü analizi tarafından sayısal. 12
Metabolik eşleme deneylerin bir başka gösteren örnek bir görüntü insan glioblastoma hücreleri enjekte fare beyin cryostat bölümünün Şekil 2, gösterilir. IDH1/2 insan beyninin en önemli NADPH sağlayıcısında ve NADPH üretim kapasitesi IDH1/2 kemirgenler beyinlerinde çok daha düşüktür, ancak faaliyete upregulated vahşi tipli IDH1/2 glioblastoma içinde. 11 Şekil 2A yüksek NADP+arasındaki farkı gösterir-bağımlı IDH1/2 etkinlik insan glioblastoma hücrelerinde ve düşük NADP+-bağımlı IDH1/2 aktivitesinde sağlıklı fare beyin. IDH1/2 etkinlik µmol NADPH üretim başına mL / dakika Şekil2B doku olarak sayılabilir.
IDH1/2, enzimatik reaksiyon nispeten basit ama laktat dehidrogenaz (karaciğer) daha karmaşık enzim kompleksi. Karaciğer tersinir dönüştürme laktat pyruvate NAD+ NADH ya da tersini eşlik eden azaltılması ile dönüştürür. Laktat ve pyruvate kullanılabilirliğini ve karaciğer enzim kompleksi kompozisyon laktat öncelikle (ki karaciğer-B tarafından katalizlenir ve NADH verimleri) pyruvate veya olup pyruvate öncelikle laktat dönüştürülür (olan dönüştürülür olup olmadığını belirler Karaciğer-A tarafından katalize ve NADH tüketir). 13 metabolik eşleme deneyler karaciğer-B reaksiyon etkinlik görselleştirmek, ancak onlar NADH üretim oluşmaz ve sonuç olarak nitroBT formazan için azalır değil çünkü "kör" karaciğer-A tepki etkinlik için. Şekil 3 gösterir NAD+-bağımlı karaciğer etkinlik (yani pyruvate laktat dönüşüm) insan beyin bölümleri substrat (Şekil 3A), yokluğunda laktat (Şekil 3B yüksek bir konsantrasyon varlığında ), 6 mM laktat (Şekil 3 c) huzurunda ve laktat düşük konsantrasyon ve pyruvate (şekil 3D) daha yüksek bir konsantrasyon. Bu deneylerin sonuçlarını metabolik göstermek yeterli eşleme yakalar NAD+-bağımlı karaciğer doku bölümleri faaliyete laktat ve pyruvate tepki orta bağlıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
Resim 1 . NADP+-insan kolorektal karsinom hücre bağımlı IDH1/2 etkinlik. (A)temsilcisi monokromatik ışık photomicrographs HCT116 insan kolorektal karsinom hücre NADP+için boyama sonra-bağımlı IDH1/2 etkinlik 1-10 mM isocitrate ve 0.8 mM NADP+karşı. Ölçek çubukları 50 µm mavi formazan absorbans bir miktar üzerinden nitroBT NADP+tarafından üretilen. (B) =-hücre bağımlı IDH1/2 yansıtılmasında monokromatik ışık (a) ve görüntü analizi kullanılarak gösterilir. Kısaltmalar: IDH1WT/WT, isocitrate dehidrogenaz 1 yaban tipi; IDH1WT/MUT, isocitrate dehidrogenaz 1 mutasyona uğramış. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
Resim 2 . NADP+-bağımlı IDH1/2 etkinlik insan glioblastoma örnekleri. NADP+için boyama sonra sağlıklı fare beyin (h) ve bir insan glioblastoma tümör xenograft (t) içeren bir fare beyin bölümünün(a)temsilcisi photomicrograph-0,8 huzurunda bağımlı IDH1/2 etkinlik mM NADP+ ve 2 mM isocitrate. Ölçek çubuğu 200 µm (B) enzim aktivitesi miktar alanlarında fare beyin (h) ve (A) Lambert-bira Kanunu kullanılarak gösterilen insan glioblastoma xenograft (t) =. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
Şekil 3 . NAD+-insan beyni örnekleri bağımlı laktat dehidrogenaz (karaciğer) etkinliği. NAD+için boyama sonra insan beyni örnekleri seri kesimlerinin temsilcisi photomicrographs-bağımlı karaciğer etkinlik(a)kontrol koşullarda (devamsızlık substrat ve pyruvate, 3 mM NAD+ sadece) (B) karşı karşı 150 mM laktat yokluğunda pyruvate (C) karşı 6 mM, 6 mM laktat 18 mM pyruvate, rekabetçi ürün inhibitörü laktat pyruvate tepki huzurunda karşı pyruvate ve (D) yokluğunda laktat. Ölçek çubuğu 200 µm. = <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enzim:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>KARACİĞER</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA %18 100 mM fosfat tampon</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL;  pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL;  pH 8.0 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 8.0 =</td>
			<td>1 mL; pH 8.0 =</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NitroBT</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NaN3 </td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM MgCl2</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8 mM NADP</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>substrat</td>
			<td>10 mM glikoz-6-fosfat</td>
			<td>150 mM laktat</td>
			<td>50 mM süksinat</td>
			<td>100 mM malik asit</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>10 mM 6-Fosfo-galactonate</td>
			<td>10 mM glutamik asit</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.32 mM MPM'ler</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2 mM PMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kuluçka süresi</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>60 dk</td>
			<td>60 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>30 dk</td>
		</tr>
</tbody></table>
Tablo 1. Dehydrogenases için metabolik eşleme iletişim kuralı şematik bakış. Kısaltmalar: ADP, adenozin nükleotittir; (m) PMS (metoksi) -5-methylphenazinium metil sülfat; nitroBT, nitro tetrazolium mavi klorür; G6PDH, glikoz-6-fosfat dehidrogenaz; Karaciğer, laktat dehidrogenaz; SDH, süksinat dehidrogenaz; MDH, malat dehidrogenaz; IDH, isocitrate dehidrogenaz; 6PGD, 6-phosphogluconate dehidrogenaz; GDH, glutamat dehidrojenaz.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Burada, mikroskobik görselleştirmek ve dehydrogenases hücre ve dokulara ve onun kinetik, işlev ve hücre altı yerelleştirme etkinliğini ölçmek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut.

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

metabolic-mapping-quantitative-enzyme-cytochemistry-histochemistry-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Görüntüleme.  University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. Burada, mikroskobik görselleştirmek ve dehydrogenases hücre ve dokulara ve onun kinetik, işlev ve hücre altı yerelleştirme etkinliğini ölçmek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase solubility and facilitate excretion. On some occasions those structural modifications lead to the formation of new toxic products. In order to reduce animal testing, chemical risk can be assessed using metabolically competent cells. The expression of metabolic enzymes, however, is not stable over time in many in vitro primary culture systems and is often partial or absent in cell lines. Therefore, the study of medicines, additives, and environmental pollutants metabolism in vitro should ideally be conducted in cell systems where metabolic activity has been characterized. We explain here an approach to measure the activity of a class of metabolic enzymes (Human Phase I) in 2D cell lines and primary 3D cultures using chemical probes and their metabolic products quantifiable by UPLC mass spectrometry and luminometry. The method can be implemented to test the metabolic activity in cell lines and primary cells derived from a variety of tissues.

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Metabolic competency of in vitro systems is a key requirement for the biotransformation and disposition of drugs and toxicants. In this protocol, we describe the application of reference metabolic probes to assess phase I metabolism in cell cultures.

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize<em&gt; İn Vitro</em&gt; Hücre Kültürleri

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Biyokimya

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by environmental organochlorine pesticides (OCPs) in hepatocytes. HepG2 cells were exposed to &#946;-hexachlorocyclohexane (&#946;-HCH) for 24 h at an equivalent dose of internal exposure in general population. Ultrastructure in hepatocytes was examined by transmission electron microscopy (TEM) to show the damage of mitochondria. Mitochondrial function was further evaluated by mitochondrial fluorescence intensity, adenosine 5'-triphosphate (ATP) levels, oxygen consumption rate (OCR) and mitochondrial membrane potential (MMP) in HepG2 cells incubated with &#946;-HCH. The mitochondria fluorescence intensity after stained by mitochondrial green fluorescent probe was observed with a fluorescence microscopy. The luciferin-luciferase reaction was used to determine ATP levels. The MMP was detected by the cationic dye JC-1 and analyzed under flow cytometry. OCR was measured with an extracellular flux analyzer. In summary, these protocols were used in detecting mitochondrial function in hepatocytes with to investigate mitochondria damages.

Understanding the influence of environmental organochlorine pesticides (OCPs) on mitochondrial function in hepatocytes is important in exploring the mechanism of OCPs causing metabolic disorders. This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function.

Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Çevre

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

DHODH ve SDH Aktivitelerini Ölçmek için Kararlı İzotop İzleme ve LC-MS Analizi

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Yazar Spotlight: Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Testler  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in understanding the role of mitochondrial function in obesity, diabetes, aging, cancer, cardiovascular function and safety toxicity.
Cellular metabolism is the process of substrate uptake, such as oxygen, glucose, fatty acids, and glutamine, and subsequent energy conversion through a series of enzymatically controlled oxidation and reduction reactions. These intracellular biochemical reactions result in the production of ATP, the release of heat and chemical byproducts, such as lactate and CO2 into the extracellular environment.
Valuable insight into the physiological state of cells, and the alteration of the state of those cells, can be gained through measuring the rate of oxygen consumed by the cells, an indicator of mitochondrial respiration - the Oxygen Consumption Rate - or OCR. Cells also generate ATP through glycolysis, i.e.: the conversion of glucose to lactate, independent of oxygen. In cultured wells, lactate is the primary source of protons. Measuring the lactic acid produced indirectly via protons released into the extracellular medium surrounding the cells, which causes acidification of the medium provides the Extra-Cellular Acidification Rate - or ECAR.
In this experiment, C2C12 myoblast cells are seeded at a given density in Seahorse cell culture plates. The basal oxygen consumption (OCR) and extracellular acidification (ECAR) rates are measured to establish baseline rates. The cells are then metabolically perturbed by three additions of different compounds (in succession) that shift the bioenergetic profile of the cell.
This assay is derived from a classic experiment to assess mitochondria and serves as a framework with which to build more complex experiments aimed at understanding both physiologic and pathophysiologic function of mitochondria and to predict the ability of cells to respond to stress and/or insults.

A description of a method for profiling mitochondrial function in cells is provided. The mitochondrial profile generated provides four parameters of mitochondrial function that can be measured in one experiment: basal respiration rate, ATP-linked respiration, proton leak, and reserve capacity.

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Biyoloji

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Terapötik ve Biyoinsektisit Uygulamaları için Mitokondriyal Fonksiyonun Değiştirilmesi

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). However, their significance extends far beyond energy production. Dysregulation of mitochondrial bioenergetics can trigger intracellular cascades that impact health and cellular function. Given their physiological importance, there is growing interest in exploring the pharmacological potential of mitochondrial function for developing new therapies and bioproducts. Modulating mitochondrial bioenergetics could provide innovative approaches to address challenges such as neurodegenerative disorders, metabolic diseases, and cancer, as well as to develop bioproducts for controlling pests and vector-borne diseases.
This work presents a method for assessing the effects of xenobiotics on the electron transport chain (ETC) using various substrates, including glutamate and NADH for complex I, succinate for complex II, and cytochrome c (both oxidized and reduced) for complexes III and IV. This methodology allows the activation or inhibition of electron transport through mitochondrial complexes to be evaluated using a respirometer and spectrophotometer. The mitochondria can be sourced from isolated mitochondria, fragmented cells, or homogenized tissue from various species.
In the laboratory, mitochondrial function has been analyzed in Aedes aegypti and Wistar rats, but this method is also applicable to other species, such as Rhipicephalus microplus and Rhodnius prolixus. This approach provides the basis for theorizing about the existence of uncoupler proteins and species-specific oxidizable substrate preferences influenced by their unique energetic demands. Recent findings offer valuable insights into innovative bioinsecticide design strategies that target mitochondrial function, holding significant potential for effectively controlling vector-borne diseases and pest infestations.

<meta charset="utf8"></head><body>İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler

This study introduces a methodology for studying xenobiotic effects on mitochondrial function via respirometric and enzymatic assays. It examines electron transport chain modulation in various species, offering insights for targeted biopesticide development against insect vector-borne diseases.

İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize

Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

İzole Mitokondride Ksenobiyotik Taşınma ve Etkilerinin Ortaya Çıkarılması: Respirometrik ve Enzimatik Testlerden Görüşler