Name: inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation at JoVE.com

Yazar James Madison Üniversitesi Biyoloji bölümü ve James Madison Üniversitesi ışık mikroskobu ve tesis Imaging cömert destek teşekkür ederiz. Dr. Mark L. Gabriele için yararlı tavsiyeler genç doğum sonrası doku hazırlık, ilgili ve Drs. Justin W. Brown ve Corey L. Cleland cerrahi malzemeler ve mekan cömert koordinasyon için. Bu araştırma kısmen 4-VA, ilerleyen Virginia Commonwealth (G.S.V.) için işbirliğine dayalı bir ortaklık tarafından ve tarafından bir Virginia Akademisi bilim küçük proje araştırma Grant'ın (G.S.V.) bir ortak araştırma hibe tarafından finanse edildi. Destek cömertçe sağlanmıştır Betty Jo sevgi dolu Butler 58 ' bağış tarafından lisans araştırma bursu (için K.M.B.), Farrell yaz araştırma bursu (için K.M.B.), James Madison Üniversitesi ikinci yüzyıl burs (K.M.B.), James Madison Üniversitesi Centennial burs (C.J.H.), James Madison Üniversitesi Lucy Robinson arama ' 30 Memorial burs (Z.L.H.) ve James Madison üniversiteler, bilim ve matematik Fakültesi yardım Grant (için G.S.V.).

<ol>
	<li>Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+plasticity+induced+by+inhibitory+neuron+transplantation.">Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation.</a> Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Target+Cell-Specific+Role+for+Presynaptic+Fmr1+in+Regulating+Glutamate+Release+onto+Neocortical+Fast-Spiking+Inhibitory+Neurons.">A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons.</a> J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Copy+Number+Variation+in+Human+Neurons.">Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons.</a> Science. 342 (6158), 632-637 (2013).</li><li>McConnell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersection+of+diverse+neuronal+genomes+and+neuropsychiatric+disease:+The+Brain+Somatic+Mosaicism+Network.">Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network.</a> Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).</li><li>Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+a+DNA+polymerase+beta+gene+segment+in+T+cells+using+cell+type-specific+gene+targeting.">Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting.</a> Science. 265 (5168), 103-106 (1994).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Contributions+to+Synaptic+and+Learning+Abnormalities+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).</li><li>Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+with+inducible+cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice.">Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).</li><li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Analysis+with+Double+Markers+in+Mice.">Mosaic Analysis with Double Markers in Mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+dissection+of+Lis1+and+Ndel1+in+neuronal+migration.">Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration.</a> Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).</li><li>De la Rossa, A., Jabaudon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+rapid+gene+delivery+into+postmitotic+neocortical+neurons+using+iontoporation.">In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation.</a> Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).</li><li>Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-autonomous+role+of+excitatory+synaptic+transmission+in+the+regulation+of+neuronal+structure+and+function.">The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function.</a> Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+5A+inhibits+synaptogenesis+in+early+postnatal-+and+adult-born+hippocampal+dentate+granule+cells.">Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells.</a> eLife. 3, 1-24 (2014).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+Approaches+to+Study+the+Excitability+of+Neuronal+Subpopulations+and+Single-cell+Connectivity.">In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+In+utero+Electroporation.">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-Regulated+Dynamics+of+Layer+4+Neuronal+Dendrites+during+Thalamocortical+Reorganization+in+Neonates.">NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supernova:+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo.">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 35747 (2016).</li><li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice.">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).</li><li>Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ars2+maintains+neural+stem-cell+identity+through+direct+transcriptional+activation+of+Sox2.">Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2.</a> Nature. 481, 195-198 (2011).</li><li>Scotto-Lomassese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+regulates+new+neuron+differentiation+in+the+adult+olfactory+bulb.">Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmids 101: A Desktop Resource. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook. , (2015).</li><li>Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+of+the+Cotton+Rat+in+Studies+for+the+Pre-clinical+Evaluation+of+Oncolytic+Viruses.">Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses.</a> J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).</li><li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+Migration+from+Basal+Forebrain+to+Neocortex:+Dependence+on+Dlx+Genes.">Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes.</a> Science. 28 (5337), 474-476 (1997).</li><li>Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Multimodal+Analgesia+on+the+Success+of+Mouse+Embryo+Transfer+Surgery.">Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).</li><li>Kim, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase mozaik beyin doku oluşturmak için floxed farelerde ile kombinasyonu tanıtmak. Bu yaklaşımın avantajı, yeni bir fare satır farklı hücresel alt türü hedef için her zaman var olmak oluşturmak yeterli değil olmasıdır: rahim içinde elektroporasyon eksitatör nöronlar, inhibitör nöronlar veya glia süreye bağlı olarak hedeflemek için kullanılan ve konumu elektroporasyon15,16,17,18,19,20,21,34. Çünkü biz gelişmekte olan telencephalon büyük bir alan üzerinde yer olabilir 5 mm çap elektroporasyon elektrotlar kullanma bizim yaklaşım, serebral korteks tutarlı ve tekrarlanabilir hedefliyor. Alternatif siteleri (örneğin diencephalon, retina) beyindeki veya serebral korteks Berisi Bölgeler Klasiği daha özel hedefleme için hedeflemek için yordamları ve açıkça bu amaç için tasarlanmış elektrotlar kullanılan15, -ebilmek var olmak 16. Ayrıca parlak etiketleme sağlar ve her fluorescently etiketli nöron Cre recombinase içeren garanti eden tek bir yapı sağlar. Parlak etiketleme elde etmek için tek bir yapı kullanarak bir dezavantaj etiketli nüfus çok yoğun (şekil 2C) olabilir, ancak bu hücreleri (2D rakam) etiketli alan çevre Imaging tarafından çözülebilir olduğunu. Alternatif olarak, floresan bir yapı ifade Cre recombinase ifade17tarihinde bağlıdır için tasarlanmış, ancak düşük ifade düzeyleri immunostaining floresan işaretçisi için gerektirebilir. Bu sınırlama Cre-bağımlı floresan marker ifade (şekil 3A)23,24"Süpernova" sistemi tarafından ele alınmaktadır.
CRE-lox rekombinasyon rahim içinde elektroporasyon ile birleştirerek ek olarak, zaman aşımına uğradı-hamile kadın optimum üreme için çeşitli iyileştirmeler sunar. Sesler ve laminar akış davlumbaz gibi donanımları kaynaklanan titreşimleri arınmış bir holding odada fareler tutmak önemlidir. Plastik igloolarda, malzeme, iç içe geçmiş ile çevre zenginleştirmek ve ayçiçeği tohumu (malzeme listesine bakınız) gibi diyet takviyeleri. Çevresel hususlar dışında biz bir erkek ilk çöp genellikle en düşük sağkalım oranı vardır fark etmişsinizdir. Böylece, bizim Protokolü ikinci gebelik rahim içinde adım gerçekleştirmek için kadın kadar bekleyen öneriyor. Bu strateji çöp yaşama artırır iken, bu da çöp büyüklük, hangi cerrahi saat uzatmak ve böylece ameliyat başarısı daha düşük artış eğilimindedir. Bu nedenle, embriyo (örneğin 8'den daha fazla) özellikle çok sayıda karşılaşma, doku yaralanma en yatkın nerede bazı embriyoların, özellikle embriyo yumurtalık ve rahim, yakın elektroporasyon atlama okumanızı öneririz. Ayrıca, aynı çevre zenginleştirme strateji (malzeme, diyet takviyeleri iç içe geçme plastik igloolarda,) belirtilen kullanarak çöp yaşama doğumdan sonra artış eğilimindedir. O estrus birkaç saat sonra ilk çöp doğum kadın oluşabilir unutmamak önemlidir. Bu durumda, ikinci onun çöp doğum sonra çiftleşme girişimi için Sütten kesme zaman aşımına uğradı sonra ayırmak erkek izin verir. Ne zaman seyir için vajinal prizler, bir fiş bile bulunursa, özellikle dişi önceki gece içinde estrus olsaydı dişi ayırmak iyi bir uygulamadır. Fişler belirli suşları içinde fark etmek zordur ve anlayışı zaten gerçekleşmiş olabilir.
Başka bir iyileştirme rahim içinde adım için yeterli mikroenjeksiyon Pipetler üretiminde alandır. Pipetler DNA enjeksiyon için lateral ventrikül çekerek kritik bir adımdır. Burada, biz Pipetler ile tutarlı ucu boyutunu ve kaba İpucu kenar oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Diğer yöntemler geri bir neşter bıçak15 ucuyla kırılma veya forseps16,17ucuyla uzakta pinching içerir. Pipet ipuçları çok küçük ise, doğru bir şekilde rahim duvarı ponksiyon ancak enjeksiyon akış oranları çok düşük, pipet embriyonik beyinde sıkıştığı sanılıyor zaman uzatma olacak unutmayın. Pipet ipuçları çok büyük iseniz, rahim duvarı ve embriyonik beyin zarar verebilir. Pipet ipuçları çok düzgündür, onlar büyük bir divot rahim duvarı ve/veya embriyonik kafatası içinde muhtemelen embriyo zarar aracılığıyla, kırma önce neden olur. 20-25 µm bahşiş üretmek ve ipuçları (örneğin 10 X amacı ile) basit bir ışık mikroskop altında incelemek için kaba bir ara oluşturma uygulama kadar tutarlı bir sonuç elde edilir. O sıvı test olabilir bir aspiratör boru montaj ile makul oranda (örneğin ~0.5 µL/s) pipetted, ucu boyutunu kabul edilebilir bir Aralık dahilindeyse olduğunu kontrol ettikten başka bir yöntemdir. Enjeksiyon Pipetler kalibre edilmiş ve mezun oldu, lateral ventrikül teslim DNA miktarı bilinir. Bu istenen sparseness tekrarlanarak için bir büyüklük elde etmek için en önemli adımdır. Başka bir deyişle, belirli bir konsantrasyon belirli bir aralık içinde örneğin 10-100 etiketli nöronlar etiketleme verim.
Protokol konusunda en önemli adım rahim içinde adım işlemdir. Rahim teşhir ederken son derece nazik ol. Karın boşluğu üzerinden geçen embriyo çekerek, yumurtalık veya rahim boynu çek değil emin olun. Başparmak ve işaret parmağı mikroenjeksiyon ve elektroporasyon sırasında kullanarak lateral ventrikül ortaya çıkarmak için embriyo nazik, hünerli manipülasyon ve yavaşça rahim duvara itti embriyo olanak sağlar. Son derece nazik bir dokunuş rahim ve embriyo işlerken önemlidir. Bu nazik bir dokunuş elde etmek zordur, halka forseps bir yerleşik sınırı vida ile bir embriyo veya doku hasarına neden olan rahim, sıkma forseps engellemek için kullanın. Carprofen ve buprenorfin ameliyattan hemen önce yönetmek için daha fazla dikkat etmeniz gereken, embriyonik hayatta kalma etkilemeden rahim içinde ameliyat sırasında etkili ağrı yönetimi sağlamak için görünür bir uygulama35 oranları .
Bizim Basitleştirilmiş histolojik yordamı uygulamadan, birkaç adım kritik öneme sahiptir. Deneysel beyin sabitleştirici ile Ventriküler sonra beyin beyin dokusuna zarar sırasında sonrası fiksasyon korumak için kafatasını sağlam tutmak. Beyin % 1 İngiltere'de yılın çözüm polymerizes gibi PFA gün haftalar, o floresan Not düşecektir depolamak mümkün iken. 100 µm Dilimleme koronal bölümler olduğunu confocal mikroskobu tüm bölüm dendritik ve aksonal Morfoloji çoğunu korurken izin vermek için genellikle ince. Fiksasyon düzgün oluştuysa, hayvanlardan P13 büyük beyin sadece cyanoacrylate tutkal ile titreşimli microtome üzerine monte edilebilir. Beyin titreşimli microtome tarafından kesim sırasında çok esnek ise, ancak, bir küçük agar veya özel blok kesitli iken bükme gelen önlemek için beyin arkasında aşağı tutkal. Sorun çözülmezse, beyin genç doğum sonrası beyin yerine (Adım 5,8) önerilen titreşimli microtome ile kesmek için bir blok oluşturmak için agar katıştırın.
Bu yöntem Cre-lox rekombinasyon sistemi nöronlar genlerin hücre özerk işlev eğitim için kullanılan mozaik oluşturmak için rahim içinde elektroporasyon ile birleştirir. Bu yöntem aynı zamanda rahim içinde elektroporasyon gen yapıları (örneğin CRISPR/Cas9)6veya olabilir diğer siteye özgü adlandırılan (örneğin Flp/FRT veya Dre/rox24), düzenleme desteklemek üzere yapılandırılmış Mozaik beyin dokusu üretmek için tasarlanmış. Mozaik doku üretmek için kullanılabilecek bir gelecek vaat eden alternatif yenidoğan fareler36İntraventriküler enjeksiyon yoluyla viral teslim tekniktir. Embriyonik yaş olarak gösterdiği, İntraventriküler enjeksiyon ile burada ve başka yerlerde15,16,17,18,19,20birlikte, 21,22,37, viral vektörler Cre recombinase için kodlama önce doğum floxed progenitör hücre ventrikül bölgede bulaştırmak için teslim. Bir kritik dikkate viral vektörler yeterince seyrek eksizyon ve etiketleme elde etmek için seyreltilmiş sağlamak olacaktır. Ancak, bu da floresan işaretleri nöroanatomik gözlemler (örneğin dendritik dikenleri veya arborization)24için gerekli dahil olmak üzere teslim edilen yapı, alt kopya rakamlarla neden olacaktır. Bu bir tuzak, yeni yapıları "Süpernova" olarak aynı stratejiyi kullanarak sayaç için aşağıda gösterildiği yapıları etiketli hücreleri24parlaklığını karşılık gelen bir azalma olmadan seyrek etiketleme elde etmek için kullanılabilir. Teslim edilen yapıları rehberleri okudu hücre nüfus (örneğin eksitatör piramidal nöronların) belirli olması için viral teslim ile başka bir kritik unsurlardan biridir. Viral vektörler İntraventriküler enjeksiyon nerede kortikal ve Hipokampal eksitatör nöronlar oluşturulur, sadece ventrikül bölgenin dorsal telencephalon de dahil olmak üzere ventrikül çevresindeki tüm doku aynı zamanda medial enfeksiyonu neden olur ve lateral ganglionic efendiler burada birçok kortikal interneurons34doğarlar. Başka bir rahim içinde elektroporasyon yapıları, viral teslim karşılaştırıldığında nispeten dar zaman penceresi teslimat özelliğidir. Lateral ventrikül enjekte virüs ventrikül bölge astar hücreleri enfekte devam ameliyattan sonra devam edebilir. Buna ek olarak, çok daha özel bir hücre kümesi hedefleme saniyede çoğalmasıyla oluşur. Bu bir avantaj ya da dezavantaj belirlenmesi için hücre subpopulation bağlı olarak araştırmacı için olabilir.
Yaklaşımımız Cre-lox rekombinasyon tek bir yapı veya "Süpernova" yapıları tarafından destekler. "Süpernova" yapıları söz konusu olduğunda biz müfettişler avantajları ve bu strateji kullanarak sınırlamaları ile tanımak için teşvik. Örneğin, Cre silme işlemini zamanlama Katman II/III eksitatör nöronlar serebral korteks242 gün içinde gerçekleşmesi için kanıtlanmıştır. Böylece, üzerinde 48 elektroporasyon takip, yerine hemen ardından elektroporasyon h Cre eksizyon meydana gelebilir akla yatkın. Bu nedenle, zamanlama ve Cre eksizyon (Cre muhabir fare satırını kullanarakörneğin ) konumunu corroborating diğer formları özellikle Cre eksizyon küçük bir zaman çerçevesi içinde bir kritik nerede çalışmalarda yeni bu tekniğin kullanımı tamamlayacak şekilde kullanılması gerektiğini dikkate. Başka bir potansiyel hatadır "Süpernova" deney etiketlenmemiş hücrelerde küçük bir yüzdesi Cre recombinase ifade olabilir olduğunu. Örneğin, şekil 3' te biz co-electroporated iki plazmid: CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE yüksek konsantrasyon ve TRE-Cre düşük konsantrasyon. TRE bir bulky organizatörü olduğu için bu nadir bir olay olsa Cre recombinase TRE-Cre plazmid ama değil loxP-dur-loxP-EGFP-tTA plazmid, alınan hücrelerde ifade edilebilmektedir anlamına gelir. Tüm etiketsiz hücreleri yok Cre-aracılı eksizyon olursa olsun var, "Süpernova" deney ile kontrol hangi Cre recombinase ifade dışında nöronlar etiketli deneme takıma gerekebilir temel nerede bir deneyde değerlendirildi yoluyla diğer (örneğin Cre recombinase immünhistokimya) anlamına gelir.
Özet olarak, bizim iletişim kuralı kolayca rahim içinde elektroporasyon yapım bir daha yararlı ve uyarlanabilir yöntemi mozaik analiz için bu yeni yapıları içerecek şekilde değişiklik. Böylece, rahim içinde elektroporasyon mozaik beyin dokusu içinde vivoeğitim için birden çok şekilde genetik rekombinasyon gücü ile kombine edilebilir.

Genetik bir mozaik üreten ilgi bir gen işlevini anlamak için deneysel bir klasik örnektir. Bir gen bir hücresel fenotip için gerekli olup olmadığını belirlemek için en basit yaklaşım organizma (örneğin nakavt) boyunca gen fonksiyon kaybına neden oluyor. Ancak, bir gen özellikle belirli bir hücre türü içinde gerekli belirlemek için nakavt gen organizma boyunca geçerli bir yaklaşım değildir. Bunun yerine, bir yöntem gereklidir bu-ecek neden bir gen fonksiyon kaybı belirli bir hücrenin wildtype (Yani genetik olarak soğukkanlı) doku tarafından çevrili iken — başka bir deyişle, mozaik doku oluşturma. Eğer bir mutant fenotip mutant hücre gösterir ama çevreleyen wildtype hücreleri hücre özerk bir şekilde gen fonksiyonları yok. Analiz mozaik doku, mutasyona uğramış hücreler wildtype doku ile çevrili olan genlerin, özellikle nerede neurons ve glia dokusunun geniş bir birbirine bağlı ağ oluşturmak beyin hücre özerk işlevleri anlamak için idealdir.
Mozaik beyin dokusunun birkaç form genlerin hücre özerk fonksiyonlarını araştırmak için güçlü modeller hazırladık. Çalışmalar nöronal nakli1' de, kadın X'e mozaizm2,3,4, odaklı ve endojen somatik mozaizm5,6 çizilmiş onların sonuçlar mozaik üzerinde dayalı beyin dokusu. Bir genin Cre-lox rekombinasyon sistemi aracılığıyla koşullu silme transgenik fare satırları büyük kullanılabilirliğini yararlanır bir yöntemdir. Bu yöntemde, iki loxP site gideriş o ("floxed") aynı yönde iki yüz loxP siteleri tarafından çevrili bir gen (örneğin bir exon), gerekli bir dizi her iki tarafında tanıtılmaktadır. CRE recombinase loxP siteleri7arasında sıra excises. CRE-aracılı rekombinasyon geçiş floxed fareler Cre recombinase ile birlikte bir alt hücre ("Cre muhabir çizgi") floresan işaretleyicisinde ifade başka bir fare çizgi için elde edilebilir. Bu işlevleri eksitatör nöronlar veya astrocytes8gibi hücrenin alt kümeleri içinde bir gen ortaya çıkarmak için yol çeşitli göstermiştir. CRE muhabir satırları Cre-aracılı rekombinasyon uyuşturucu indüklenebilir (tek-nöron indüklenebilir Cre-aracılı nakavt veya KAYGAN ile etiketleme) olmak izin vermek için CreERT2 ifade9. Mozaik analiz çift işaretleri (MADM)10,11ile adı verilen başka bir strateji, heterozigoz dokusu ile birlikte oluşturulacak homozigoz mutant interchromosomal rekombinasyon Cre-aracılı sağlar. Bu yaklaşımlar, farelerin yeni bir satır her aday gen ya da mercek altına alındı hücresel alt türü için her zaman üretilmesi gerekiyor. Alternatif olarak, Cre recombinase postnatally İyontoforez12 veya viral vektörler (hücresel alt türü özel taşıyanörneğin adeno ilişkili virüs13 ya da lentiviruses14 aracılığıyla tanıttı olabilir Organizatör). Bu strateji etiketleme güçlü ve postnatal oluşturur. Seyrek ve prenatally serebral kortikal nöronlar geliştirme hedeflemek için bir ideal Cre recombinase floresan bir marker ile rahim içinde elektroporasyon stratejisidir.
CRE-lox rekombinasyon üretmek için rahim içinde elektroporasyon ile birleştirerek yanı sıra doku vivo içindeMozaik, biz diğer yayımlanmış protokolleri15,16yordamları için çeşitli uyarlamalar tanıtmak, 17,18,19,20,21. Üreme zaman aşımına uğradı-hamile kadın başarısında geliştirmek için bilgi veriyoruz. Biz de seyrek ve parlak kortikal doku nöronlarda etiketlerine göre tanıtmak bizim iki strateji anahat: bir strateji bir tek yapı Cre recombinase ve floresan marker22için kodlama düzeyleri titre etmektir. Bu parametreler zihin23,24ile özel tasarlanmış "Süpernova" sistemini kullanmak için başka bir stratejidir. Ayrıca, biz tutarlı mikroenjeksiyon Pipetler ve basitleştirmeler rahim içinde elektroporasyon cerrahi üretmek geliştirmeleri sunar. Son olarak, biz daha fazla boyama ve immünhistokimya dendritik spines ve dendritik ve aksonal arbors, analizini verir basitleştirilmiş bir histolojik hazırlık kritik adımlar verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>See &quot;1. Mouse set-up&quot; (step 1.1, &quot;wildtype mice&quot;)</td></tr><tr><td>GFP.Cre empty vector</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker&quot;). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;Supernova&quot; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;Supernova&quot; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;Supernova&quot; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.3 &quot;endotoxin-free plasmid purification kit&quot;)</td></tr><tr><td>Trypan Blue powder, BioReagent grade</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;trypan blue&quot;)</td></tr><tr><td>Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2.5KG</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;NaCl&quot;)</td></tr><tr><td>Potassium Chloride, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;KCl&quot;)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&quot;)</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&quot;)</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;HCl&quot;)</td></tr><tr><td>P-97 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.1 &quot;glass capillary puller&quot;)</td></tr><tr><td>3.0 mm wide trough filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>FT330B</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.1 &quot;glass capillary puller&quot;)</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries, 4&quot;, 1 / 0.75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.1.1 &quot;glass capillary&quot;)</td></tr><tr><td>Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5&quot;</td><td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.2.1 &quot;single-ply task wipe&quot;); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.</td></tr><tr><td>Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;Graefe forceps&quot;)</td></tr><tr><td>Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;iris scissors&quot;)</td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;Hartman mosquito forceps&quot;)</td></tr><tr><td>General Purpose Non-Woven Sponges, 2&quot; x 2&quot;, 4-ply</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;non-woven gauze sponges&quot;)</td></tr><tr><td>Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;ring-tipped forceps&quot;)</td></tr><tr><td>Pyrex petri dishes complete, O.D. &amp;times; H 100 mm &amp;times; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;Petri dishes&quot;)</td></tr><tr><td>Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8&quot; x 9-3/4&quot; x 5/8&quot;</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;stainless steel tray&quot;)</td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrode, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.3 and 4.16 &quot;tweezer-type electrodes&quot;)</td></tr><tr><td>ECM 830 Foot Pedal</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.3 and 4.17 &quot;foot pedal&quot;)</td></tr><tr><td>ECM 830 Generator</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.3 &quot;generator&quot;)</td></tr><tr><td>Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#72-6468</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.4 and 4.6 &quot;nose cone&quot;, step 4.4 &quot;induction chamber&quot;)</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.7 &quot;veterinary ophthalmic ointment&quot;)</td></tr><tr><td>Space Gel (AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.8 &quot;sealed pouch filled with supersaturated salt solution&quot;)</td></tr><tr><td>Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.9 &quot;depilatory cream&quot;)</td></tr><tr><td>10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)</td><td>Phenix Research Products</td><td>TSP-10LKIT</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.12 &quot;sterile 10 &amp;micro;L micropipette tip&quot;)</td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.15 &quot;aspirator tube assembly&quot;)</td></tr><tr><td>Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27&quot;</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.19 &quot;absorbable sutures&quot;)</td></tr><tr><td>&amp;ldquo;LiquiVet Rapid&amp;rdquo; Tissue Adhesive</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.20 &quot;tissue adhesive&quot;)</td></tr><tr><td>Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.21 &quot;1 mL syringe&quot;)</td></tr><tr><td>BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.21 &quot;26G, &amp;frac12;&amp;rdquo; needle&quot;)</td></tr><tr><td>Nestlets Nesting Material</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.24 &quot;nesting materials&quot;)</td></tr><tr><td>Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile</td><td>Bio-Serv</td><td>S5137</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.24 &quot;sunflower seeds&quot;)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.1.1 &quot;PFA&quot;)</td></tr><tr><td>Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.5 &quot;tweezers&quot;)</td></tr><tr><td>Agar powder</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.8.1 &quot;agar&quot;)</td></tr><tr><td>Single-edge razor blades, #9 blade</td><td>Stanley Tools</td><td>#11-515</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.9 &quot;single-edge razor blade&quot;)</td></tr><tr><td>Specimen disc S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.9 &quot;vibrating microtome specimen disc&quot;)</td></tr><tr><td>Buffer tray S assembly</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;buffer tray&quot;)</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;vibrating microtome&quot;)</td></tr><tr><td>Double Edge Razor Blades</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;blade&quot;)</td></tr><tr><td>Knife Holder S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;knife holder&quot;)</td></tr><tr><td>Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set</td><td>Amazon</td><td>B0089KU6XE</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.1 &quot;fine tipped paintbrush&quot;)</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>#71869-11</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.1 &quot;microscope slide&quot;)</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.3-5.12.4 &quot;mountant&quot;)</td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS1415-10</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.4 &quot;coverslip&quot;)</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.13.1 &quot;DAPI&quot;)</td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;light microscope&quot;)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;confocal microscope&quot;)</td></tr><tr><td>4x objective, NA = 0.20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;low-power objective&quot;)</td></tr><tr><td>20x objective, NA = 0.75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;medium-power objective&quot;)</td></tr><tr><td>60x objective, NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;high-power objective&quot;)</td></tr></tbody></table>

inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation

Genlerin hücre özerk nöronal işlevleri kaybına neden tarafından ortaya ya da küçük ve seyrek nüfus nöronların bir genin fonksiyonunun kazanmak. Bunu yapmak için hangi genetik olarak soğukkanlı doku tarafından nöronlar kaybı veya kilo alma işlevinin bir gen ile çevrili olan bir mozaik oluşturma gerektirir. Burada, biz Cre-lox rekombinasyon sistemi ile rahim içinde elektroporasyon nöronlar genlerin hücre özerk işlev eğitim için kullanılan mozaik beyin doku oluşturmak için birleştirmek. DNA yapıları (depoları ile kullanılabilir) bir floresan etiket ve Cre recombinase, kodlama, kortikal nöronlar içinde utero kullanarak fare embriyo beynindeki loxP siteleri ile çevrili genleri içeren gelişmekte içine tanıtıldı elektroporasyon. Ayrıca, biz survivability ve tekrarlanabilirlik artırmak çeşitli uyarlamalar rahim içinde elektroporasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda bir titresi Cre-aracılı rekombinasyon nöronların seyrek veya yoğun nüfus için oluşturma içerir. Etiketli beyin dokusu histolojik hazırlıkları gerektirmez (ancak için adapte edilebilir) immünhistokimya. Kullanılan yapıları bu fluorescently Cre recombinase için gen nöronlar taşımak etiketli garanti. Histolojik hazırlıklar nöronların confocal görüntüleme dendritik ve aksonal arbors ve dendritik spines ile morfolojik analiz sağlar. Seyrek mozaik doku kaybı veya kilo alma işlevinin elde çünkü bu yöntem hücre özerk gerekliliği, çalışma ve gen ürünleri içinde vivoyeterliliği izin verir.

Tek yapı GFP. CRE electroporated E15.5 de yapıldı (malzeme listesine bakınız) ve P14 görüntülenir. Yapı konsantrasyon ve enjeksiyon hacmine bağlı olarak, bir seyrek veya yoğun sonuç22,26elde edilebilir. Örneğin, 2 mg/ml GFP 1 µL enjeksiyon. Etiketli hücre, biraz-in hangi-ebilmek var olmak parlak (şekil 1A) ve yerelleştirilmiş içinde katman II/III (şekil 1B) seyrek bir dağıtım sonuçları CRE. Doku 100 µm kalın olduğundan, dendritik arbors çoğunu (şekil 1 c) korunur. Dendritik spines (60 X; yüksek büyütme oranlarında görülebilmektedir Şekil 1 d). Aynı konsantrasyonu, 1,5 µL enjeksiyon çok yoğun (şekil 2A) Katman II/III (şekil 2B), hangi-ebilmek var olmak alt-optimal neurites ve dendritik spines (şekil 2C) kaynağı izlemek zor olduğu gibi etiketleme sonuçlanır. Ancak, bir nöron (şekil 2B) ve onunla işlemler (şekil 2E) etiketli alanı (şekil 2B) çevre içinde parlak bir hücreyi seçerek görüntü hala mümkündür.
Son olarak, seyrek bir dağıtım etiketli hücre korurken parlaklık nöronların en üst düzeye çıkarmak mümkündür. Burada, E15.5, electroporated (malzeme listesine bakınız) süpernova GFP yapıldı ve P23 görüntülenir. Unutmayın, gözlemler çeşitli postnatal yaş, çekilen beyin dokusunun temel yok görünüyor parlaklık floresan herhangi bir yapıları, yaş bir etkisi kullanılan burada23,24,26olmak. 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) ve 10 µg/mL TRE-Cre sonucu çoğunlukla parlak hücreleri (şekil 3A) Katman II/III (şekil 3B) seyrek dağılımdaki içeren bir karışımdan 1 µL enjeksiyon. Dendritik ve aksonal işlemleri (şekil 3B) ve dendritik spines (şekil 3 c) görüntülenir. Deneyim, ikisinden biri ile GFP gibi tek bir yapı hedefleme. CRE veya "Süpernova" yapıları tekrarlanarak electroporated embriyo en az %75 olarak ifade verecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig1.jpg"> Şekil 1: Sparse ve sonra rahim içinde elektroporasyon ile a tek parlak ifade oluşturmak içeren GFP ve Cre recombinase. (A)düşük-büyütme (4 X) floresan test çoğalmasıyla, E15.5 sonra P23, serebral korteksin. (B) orta-büyütme (20 X) floresan test, DAPI nükleer leke, kortikal laminasyon (ı, II/III, IV ve IV derin katmanları Katmanlar) açığa. (C) orta-büyütme (20 X) floresan test tek bir nöron. (D) yüksek-büyütme (60 X) floresan test dendritik spines ile. Ölçek Bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); ve 5 mikron (D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56675/56675fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig2.jpg"> Resim 2: Dense ve sonra rahim içinde elektroporasyon ile a tek parlak ifade oluşturmak içeren GFP ve Cre recombinase. (A)düşük-büyütme (4 X) floresan test çoğalmasıyla, E15.5 sonra P14, serebral korteksin. (B) orta-büyütme (20 X) floresan test, DAPI nükleer leke, kortikal laminasyon (ı, II/III, IV ve IV derin katmanları Katmanlar) açığa. (C) orta-büyütme (20 X) floresan test en yoğun etiketleme alandaki nöronların. (D) orta-büyütme (20 X) floresan test en yoğun etiketleme alan çevre alınan nöronların. (E) yüksek-büyütme (60 X) floresan test dendritik spines ile. Ölçek Bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); ve 5 mikron (E). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56675/56675fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig3.jpg"> Şekil 3: Sparse ve rahim içinde elektroporasyon ile süpernova GFP içeren GFP ve Cre recombinase oluşturur sonra parlak ifade. (A)düşük-büyütme (4 X) floresan test çoğalmasıyla, E15.5 sonra P14, serebral korteksin. (B) orta-büyütme (20 X) floresan test, DAPI nükleer leke, kortikal laminasyon (ı, II/III, IV ve IV derin katmanları Katmanlar) açığa. (C) orta-büyütme (20 X) floresan test tek bir nöron. (D) yüksek-büyütme (60 X) floresan test dendritik spines ile. Ölçek Bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); ve 5 mikron (D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56675/56675fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation at JoVE.com

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

inducing-cre-lox-recombination-mouse-cerebral-cortex-through-utero

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

11.6K Görüntüleme.  James Madison University. Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

Video: Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon Transgenik Modelleri Nöronal Göç Açıkları tanımlayın

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Gelişim Biyolojisi

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Biyoloji

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Nörobilim

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian corticogenesis. This procedure takes advantage of the brain ventricles to allow the introduction of DNA of interest and uses a pair of electrodes to direct the entrance of the genetic material into the cells lining the ventricle, the neural stem cells. This method allows researchers to label the desired cells and/or manipulate the expression of genes of interest in those cells. It has multiple applications, including assays targeting neuronal migration, lineage tracing, and axonal pathfinding. An important feature of this method is its temporal and regional control, allowing circumvention of potential problems related with embryonic lethality or the lack of specific CRE driver mice. Another relevant aspect of this technique is that it helps to considerably reduce the economic and temporal limitations that involve the generation of new mouse lines, which become particularly important in the study of interactions between cell types that originate in distant areas of the brain at different developmental ages. Here we describe a double electroporation strategy that enables targeting of cell populations that are spatially and temporally separated. With this approach we can label different subtypes of cells in different locations with selected fluorescent proteins to visualize them, and/or we can manipulate genes of interest expressed by these different cells at the appropriate times. This strategy enhances the potential of in utero electroporation and provides a powerful tool to study the behavior of temporally and spatially separated cell populations that migrate to establish close contacts, as well as long-range interactions through axonal projections, reducing temporal and economic costs.

Double in utero electroporation allows targeting cell populations that are spatially and temporally separated. This technique is useful to visualize interactions between those cell populations using fluorescent proteins in normal conditions but also after functional experiments to perturb genes of interest.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein silinmesi indüksiyonu yoluyla

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar'da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda