Name: inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation at JoVE.com

Os autores graças ao apoio generoso da James Madison University departamento de biologia e da facilidade de Imaging e James Madison University microscopia de luz. Dr. Mark L. Gabriele para conselhos úteis sobre preparação de jovens pós-natal tecido, e DRS Justin W. Brown e Corey L. Cleland para coordenação generoso de espaço e materiais cirúrgicos. Esta pesquisa foi financiada em parte por uma concessão de pesquisa colaborativa por 4-VA, uma parceria de colaboração para fazer avançar a Commonwealth da Virgínia (G.S.V.) e por uma Virginia Academia de ciência pequeno projeto bolsa de investigação (G.S.V.). Suporte foi generosamente fornecido por uma doação de Betty Jo amoroso Butler 58 para bolsa de pesquisa de graduação (para K.M.B.), uma bolsa de pesquisa do verão de Farrell (para K.M.B.), um James Madison University segundo século Scholarship (para K.M.B.), um James Universidade de Madison do centenário uma bolsa (C.J.H.), uma Universidade de James Madison Lucy Robinson busca 30 bolsa de Memorial (para Z.L.H.) e um James Madison Universidade faculdade de Ciências e matemática da faculdade assistência Grant (para G.S.V.).

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Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Aqui, apresentamos a combinação de eletroporação no utero com Cre recombinase em camundongos floxed para gerar o tecido cerebral de mosaico. Uma vantagem dessa abordagem é que uma nova linha de rato não precisa ser gerado cada vez um diferente subtipo de celular está a ser alvo: eletroporação no utero pode ser usada para direcionar os neurônios excitatórios, neurônios inibitórios ou glia dependendo do tempo e localização do electroporation15,16,17,18,19,20,21,34. Em nossa abordagem, visando o córtex cerebral é consistente e reproduzível porque utilizamos eletrodos de eletroporação de diâmetro de 5 mm que podem ser colocados sobre uma área grande do telencéfalo desenvolvimento. Para almejar sites alternativos no cérebro (por exemplo, diencéfalo, retina), ou para o direcionamento mais específico das regiões dentro do córtex cerebral, eletrodos projetados explicitamente para essa finalidade e procedimentos podem ser usados15, 16. também fornecemos uma única construção que oferece luminosos rotulação e garante que cada neurônio fluorescente-etiquetadas contém Cre recombinase. Uma desvantagem de usar um único construto para alcançar a rotulagem brilhante é que a população rotulada pode ser muito denso (Figura 2), mas isso pode ser resolvido por imagem células na periferia da área rotulada (Figura 2D). Alternativamente, expressão de uma construção fluorescente pode ser projetado para depender Cre recombinase expressão17, mas os níveis baixos de expressão podem exigir imunocoloração para o marcador fluorescente. Essa limitação é dirigida pelo sistema de Cre-dependente marcador fluorescente expressão (Figura 3A)23,24"Supernova".
Além de combinar a recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero , oferecemos várias melhorias para reprodução ideal das fêmeas grávidas cronometrado. É importante manter os ratos em uma sala de espera que é livre de ruídos e vibrações causadas por equipamentos tais como capas de fluxo laminar. Enriquecer o ambiente com os iglus de plástico, material de nidificação e suplementos dietéticos como sementes de girassol (ver lista de materiais). Para além de considerações ambientais, notamos que a primeira ninhada de uma fêmea normalmente tem a menor taxa de sobrevivência. Assim, nosso protocolo sugere esperar até a segunda gravidez da fêmea para executar no utero eletroporação. Enquanto esta estratégia aumenta a sobrevivência da ninhada, ele também tende a aumentar o tamanho da ninhada, que pode alongar o tempo cirúrgico e, assim, diminuir o sucesso da cirurgia. Portanto, se se deparar com um número particularmente grande de embriões (por exemplo, mais do que 8), sugerimos que ignorando a eletroporação em alguns dos embriões, especialmente os embriões mais próximos para os ovários e o útero, onde o tecido é mais propenso a lesões. Além disso, usando a mesma estratégia de enriquecimento ambiental mencionada acima (plásticos iglus, suplementos alimentares, materiais de nidificação) tende a aumentar a sobrevivência após o nascimento de ninhadas. Também é importante notar que o cio pode ocorrer no sexo feminino algumas horas após o parto da primeira ninhada. Neste caso, permitir que a fêmea dar à luz a sua segunda ninhada e, em seguida, separar após o desmame para tentar cronometrado de acasalamento. Ao olhar para plugues vaginais, é boa prática para separar a fêmea, mesmo se não for encontrado um plug, particularmente se a fêmea no cio na noite anterior. Plugues em certas cepas são difíceis de detectar, e concepção pode já ter ocorrido.
Outra área de melhoria é na produção de pipetas de microinjeção adequada para eletroporação no útero . Puxando pipetas para injeção de DNA em ventrículos laterais é um passo crítico. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a criação de pipetas com um tamanho de bico consistente e borda áspera de ponta. Outros métodos incluem volta quebrando a ponta com um bisturi de lâmina15 ou beliscar fora a ponta com fórceps16,17. Observe que se pontas de pipetas são muito pequenas, eles corretamente irão perfurar a parede uterina, mas taxas de fluxo de injeção será muito baixas, alongando o tempo em que a pipeta é apresentada no cérebro embrionário. Se pontas de pipetas são grandes demais, eles podem danificar a parede uterina e cérebro embrionário. Se pontas de pipetas são muito lisas, eles causará um torrão grande a parede uterina e/ou crânio embrionário antes de romper, possivelmente danificando o embrião. Prática, criando um tempo duro para produzir 20-25 µm gorjeta e inspecionar dicas sob um microscópio de luz simples (por exemplo, com um objectivo de X 10) até que um resultado consistente é alcançado. Testar o líquido pode ser pipetado a uma taxa razoável (por exemplo, ~0.5 µ l/s) com um conjunto de tubo aspirador é um outro método para garantir que o tamanho da ponta é dentro de um intervalo aceitável. Porque a pipeta de injeção é calibrada e formou-se, a quantidade exata de DNA entregado ao ventrículo lateral é conhecida. Este é o passo mais importante para alcançar uma dispersão desejada reproducibly para uma ordem de magnitude. Em outras palavras, uma dada concentração deve produzir rótulos dentro de um intervalo específico, por exemplo, neurônios rotulados de 10 a 100.
O passo mais importante do protocolo é o procedimento de eletroporação no útero . Ser extremamente gentil ao expor o útero. Quando arrancar os últimos embriões da cavidade abdominal, certifique-se de não puxar no colo do útero ou ovários. Usar o polegar e o indicador durante microinjeção e eletroporação permite gentil e hábil manipulação de embriões para revelar o ventrículo lateral e permite que os embriões a ser empurrada suavemente contra a parede uterina. Um toque extremamente suave é crítico ao manusear o útero e embriões. Se é difícil conseguir um toque suave, use pinça de anel com um parafuso de limite interno para impedir a pinça de aperto para baixo em um embrião ou o útero, causando danos nos tecidos. Uma consideração adicional é administrar o carprofeno e buprenorfina imediatamente antes da cirurgia, uma prática que aparece fornecer gerenciamento eficaz da dor durante a cirurgia no utero sem afetar a sobrevivência embrionária as taxas35 .
Seguindo o nosso procedimento simplificado histológico, várias etapas são críticas. Depois perfusing cérebros experimentais com fixador, manter o cérebro intacto no crânio para proteger o tecido cerebral de danos durante o pós-fixação. Enquanto é possível armazenar o cérebro em 1% PFA por dias, semanas, observar a fluorescência diminuirá como a solução PFA se polimeriza. 100 µm de corte coronais seções é normalmente é fina o suficiente para permitir a microscopia confocal através de toda a seção preservando muito da morfologia dendrítica e axonal. Se fixação ocorreu corretamente, cérebros de animais mais velhos que P13 podem ser montados na vibração micrótomo simplesmente com cola de cianoacrilato. No entanto, se o cérebro é muito maleável, enquanto sendo cortado por vibração micrótomo, cola para baixo de uma pequena ágar ou agarose bloco atrás do cérebro para impedi-lo de flexão, enquanto ele está sendo seccionado. Se o problema não for resolvido, incorpore o cérebro em ágar para formar um bloco para cortar com o micrótomo vibratório, como sugerido para o mais novo cérebro pós-natal (passo 5.8).
Este método combina o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar mosaicos que podem ser usados para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. Esse método também pode ser configurado para oferecer suporte no utero electroporation do gene edição construções (por exemplo, CRISPR/Cas9)6, ou outros site-specific recombinases (por exemplo, Flp/FRT ou Dre/rox24), que podem ser projetada para produzir o tecido cerebral de mosaico. Uma técnica alternativa promissora que poderia ser usada para produzir tecido de mosaico é viral entrega via injeção intraventricular para ratos neonatal36. Combinada com injeção intraventricular em idades embrionárias como demonstrado aqui e alhures,15,16,17,18,19,20, 21,22,37, vetores virais codificação para Cre recombinase pôde ser entregue antes do nascimento de infectar as células progenitoras floxed na zona ventricular. Uma consideração crítica seria garantir que os vetores virais são diluídos suficientemente para alcançar a excisão esparsa e rotulagem. No entanto, isto também resultaria em menor número de cópias da construção sendo entregue, incluindo marcadores fluorescentes essencial para essas observações (por exemplo, espinhas dendríticas ou arborização)24. Para combater essa armadilha, construções novas, usando a mesma estratégia como as construções de "Supernova" demonstradas aqui podem ser usadas para alcançar esparsas rotulagem sem uma correspondente diminuição do brilho de pilhas etiquetadas24. Outra consideração crítica com entrega viral é garantir construções entregues promotores específicos para população celular sendo estudada (por exemplo, neurônios pyramidal excitatórios). Injeção intraventricular de vetores virais provoca infecção de todo o tecido em torno dos ventrículos, incluindo não só a zona ventricular do telencéfalo dorsal onde corticais e hippocampal neurônios excitatórios são gerados, mas também a medial e lateral ganglionar Eminências onde muitos interneurônios corticais nascem34. Outra característica no utero electroporation comparado a entrega viral das construções é sua janela de tempo relativamente estreita da entrega. Vírus injetados dos ventrículos laterais podem persistir após a cirurgia, continuando a infectar células que revestem a zona ventricular. Em contraste, electroporation ocorre em segundos, visando um conjunto muito mais específico de células. Isto pode ser uma vantagem ou desvantagem para o investigador, dependendo da subpopulação de células a ser estudado.
Nossa abordagem suporta recombinação Cre-lox pela introdução de um único construto ou construtos "Supernova". No caso as construções "Supernova", instamos os investigadores familiarizar-se com as vantagens e limitações da utilização dessa estratégia. Por exemplo, o calendário da exclusão Cre tem demonstrado para ocorrer dentro de 2 dias nos neurônios excitatórios de camada II/III do córtex cerebral24. Assim, é plausível que Cre excisão poderia ocorrer mais a 48 h após electroporation, ao invés de imediatamente a seguir electroporation. Portanto, outras formas de corroborando calendário e localização do Cre excisão (por exemplo, usando uma linha de rato de repórter Cre) devem ser usadas para complementar o uso dessa nova técnica, especialmente em estudos onde a excisão de Cre num prazo pequeno é um crítico consideração. Outra armadilha potencial é que uma pequena percentagem de células sem rótulo em um experimento de "Supernova" poderia expressar Cre recombinase. Por exemplo, na Figura 3, podemos co-electroporated dois plasmídeos: uma alta concentração de CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE e uma baixa concentração de TRE-Cre. Porque o TRE é um promotor com vazamento, Cre recombinase poderia ser expressa em células que receberam o TRE-Cre plasmídeo mas não o plasmídeo loxP-paragem-loxP-EGFP-tTA, apesar de isto ser uma ocorrência rara. Em um experimento onde é essencial que todas as células sem rótulo tem sem qualquer tipo de excisão mediada por Cre, um experimento de "Supernova" pode precisar de ser complementada com um experimento de controle no qual Cre expressão recombinase de fora rotulado neurônios é avaliado através do outro significa (por exemplo, Cre recombinase imuno-histoquímica).
Em resumo, nosso protocolo é facilmente modificado para acomodar essas novas construções, fazendo no utero electroporation um método ainda mais útil e adaptável para a análise de mosaico. Assim, no utero electroporation pode ser combinado com o poder da Recombinação genética de várias maneiras para estudar mosaico cérebro tecido na vivo.

Gerar um mosaico genético é um paradigma clássico experimental para a compreensão da função de um gene de interesse. Para determinar se um gene é necessário para um fenótipo celular, a abordagem mais simples é causar uma perda de função do gene em todo o organismo (por exemplo, nocaute). No entanto, para determinar se um gene é necessário especificamente em um determinado tipo de célula, nocaute do gene em todo o organismo não é uma abordagem válida. Em vez disso, um método é necessário que causará a perda da função de um gene em uma determinada célula enquanto está rodeado por tecido de sua (ou seja, geneticamente imperturbável) — em outras palavras, criando tecidos de mosaico. Se a célula mutante mostra um fenótipo mutante, mas células circundantes de sua não, fazem as funções de gene de forma autónoma a célula. Análise do tecido do mosaico, no qual as células mutantes estão rodeadas por tecido de sua, é ideal para compreender a célula autónomos funções dos genes, especialmente no cérebro onde os neurônios e glia formam uma vasta rede interligada de tecido.
Várias formas de tecido cerebral de mosaico forneceram modelos poderosos para investigar a célula autónomos funções dos genes. Estudos focados em transplante neuronal1, mosaicismo feminino ligado ao X2,3,4, e mosaicismo somático endógena5,6 ter desenhado suas conclusões com base em mosaico tecido cerebral. Exclusão condicional de um gene através do sistema de recombinação de Cre-lox é um método que tira proveito da grande disponibilidade de linhas de rato transgénico. Neste método, os dois sites loxP são introduzidos em ambos os lados de uma sequência necessária de um gene (tais como um exon), deixando ladeado por loxP sites que ambos enfrentam na mesma direção ("floxed"). CRE recombinase excises a sequência entre os sites de loxP7. Mediada por CRE recombinação pode ser conseguida cruzando ratos de floxed para outra linha de rato que expressam a recombinase Cre junto com um marcador fluorescente em um subconjunto de células ("linha de repórter de Cre"). Isto foi demonstrado em uma variedade de maneiras para descobrir as funções de um gene em subconjuntos de células, como neurônios excitatórios ou astrócitos8. Linhas de repórter CRE podem expressar CreERT2 para permitir a recombinação mediada por Cre ser droga-inducible (single-neurônio etiquetando com nocaute inducible Cre-mediada, ou SLICK)9. Em outra estratégia chamada análise de mosaico com dobro de marcadores (MADM)10,11, mediada por Cre interchromosomal recombinação permite um mutante homozigoto ser criado ao lado de tecido heterozigoto. Essas abordagens, uma nova linha de mouses precisa ser produzido cada vez para cada gene candidato ou subtipo de celular que é testado. Alternativamente, Cre recombinase pode ser introduzido pós-natal a iontoforese12 ou por meio de vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associado13 ou lentivírus14 carregando celular subtipo específico promotores). Essa estratégia cria forte e pós-natal de rotulagem. Para direcionar o desenvolvimento de neurônios corticais cerebrais escassamente e pré-natal, uma estratégia ideal é no utero electroporation da Cre recombinase com um marcador fluorescente.
Além de combinar recombinação Cre-lox através no utero electroporation para produzir mosaico tecido na vivo, nós introduzimos várias adaptações aos procedimentos de outros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Nós fornecemos informações para melhorar o sucesso em grávidas cronometrado fêmeas reprodutoras. Também descrevem nossas duas estratégias para introduzir esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios no tecido cortical: uma estratégia é titula-se os níveis de um único construto codifica para Cre recombinase e um marcador fluorescente22. Outra estratégia é usar o sistema de "Supernova", projetado especificamente com esses parâmetros em mente23,24. Além disso, oferecemos melhorias na produção de pipetas de microinjeção consistente e simplificações para a cirurgia de eletroporação no útero . Finalmente, nós esboçamos passos críticos em uma preparação histológica simplificado que permite a análise de espinhas dendríticas e mandris dendríticas e axonal, sem coloração adicional ou imuno-histoquímica.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>See &quot;1. Mouse set-up&quot; (step 1.1, &quot;wildtype mice&quot;)</td></tr><tr><td>GFP.Cre empty vector</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker&quot;). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;Supernova&quot; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;Supernova&quot; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.1 &quot;Supernova&quot; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.3 &quot;endotoxin-free plasmid purification kit&quot;)</td></tr><tr><td>Trypan Blue powder, BioReagent grade</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;trypan blue&quot;)</td></tr><tr><td>Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2.5KG</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;NaCl&quot;)</td></tr><tr><td>Potassium Chloride, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;KCl&quot;)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&quot;)</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&quot;)</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>See &quot;2. DNA set-up&quot; (step 2.5 &quot;HCl&quot;)</td></tr><tr><td>P-97 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.1 &quot;glass capillary puller&quot;)</td></tr><tr><td>3.0 mm wide trough filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>FT330B</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.1 &quot;glass capillary puller&quot;)</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries, 4&quot;, 1 / 0.75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.1.1 &quot;glass capillary&quot;)</td></tr><tr><td>Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5&quot;</td><td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>See &quot;3. Pipette set-up&quot; (step 3.2.1 &quot;single-ply task wipe&quot;); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.</td></tr><tr><td>Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;Graefe forceps&quot;)</td></tr><tr><td>Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;iris scissors&quot;)</td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;Hartman mosquito forceps&quot;)</td></tr><tr><td>General Purpose Non-Woven Sponges, 2&quot; x 2&quot;, 4-ply</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;non-woven gauze sponges&quot;)</td></tr><tr><td>Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;ring-tipped forceps&quot;)</td></tr><tr><td>Pyrex petri dishes complete, O.D. &amp;times; H 100 mm &amp;times; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;Petri dishes&quot;)</td></tr><tr><td>Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8&quot; x 9-3/4&quot; x 5/8&quot;</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.1 &quot;stainless steel tray&quot;)</td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrode, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.3 and 4.16 &quot;tweezer-type electrodes&quot;)</td></tr><tr><td>ECM 830 Foot Pedal</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.3 and 4.17 &quot;foot pedal&quot;)</td></tr><tr><td>ECM 830 Generator</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.3 &quot;generator&quot;)</td></tr><tr><td>Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#72-6468</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.4 and 4.6 &quot;nose cone&quot;, step 4.4 &quot;induction chamber&quot;)</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.7 &quot;veterinary ophthalmic ointment&quot;)</td></tr><tr><td>Space Gel (AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.8 &quot;sealed pouch filled with supersaturated salt solution&quot;)</td></tr><tr><td>Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.9 &quot;depilatory cream&quot;)</td></tr><tr><td>10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)</td><td>Phenix Research Products</td><td>TSP-10LKIT</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.12 &quot;sterile 10 &amp;micro;L micropipette tip&quot;)</td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.15 &quot;aspirator tube assembly&quot;)</td></tr><tr><td>Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27&quot;</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.19 &quot;absorbable sutures&quot;)</td></tr><tr><td>&amp;ldquo;LiquiVet Rapid&amp;rdquo; Tissue Adhesive</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.20 &quot;tissue adhesive&quot;)</td></tr><tr><td>Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.21 &quot;1 mL syringe&quot;)</td></tr><tr><td>BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.21 &quot;26G, &amp;frac12;&amp;rdquo; needle&quot;)</td></tr><tr><td>Nestlets Nesting Material</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.24 &quot;nesting materials&quot;)</td></tr><tr><td>Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile</td><td>Bio-Serv</td><td>S5137</td><td>See &quot;4. In utero electroporation&quot; (step 4.24 &quot;sunflower seeds&quot;)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.1.1 &quot;PFA&quot;)</td></tr><tr><td>Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.5 &quot;tweezers&quot;)</td></tr><tr><td>Agar powder</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.8.1 &quot;agar&quot;)</td></tr><tr><td>Single-edge razor blades, #9 blade</td><td>Stanley Tools</td><td>#11-515</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.9 &quot;single-edge razor blade&quot;)</td></tr><tr><td>Specimen disc S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.9 &quot;vibrating microtome specimen disc&quot;)</td></tr><tr><td>Buffer tray S assembly</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;buffer tray&quot;)</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;vibrating microtome&quot;)</td></tr><tr><td>Double Edge Razor Blades</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;blade&quot;)</td></tr><tr><td>Knife Holder S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.10 &quot;knife holder&quot;)</td></tr><tr><td>Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set</td><td>Amazon</td><td>B0089KU6XE</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.1 &quot;fine tipped paintbrush&quot;)</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>#71869-11</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.1 &quot;microscope slide&quot;)</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.3-5.12.4 &quot;mountant&quot;)</td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS1415-10</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.12.4 &quot;coverslip&quot;)</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.13.1 &quot;DAPI&quot;)</td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;light microscope&quot;)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;confocal microscope&quot;)</td></tr><tr><td>4x objective, NA = 0.20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;low-power objective&quot;)</td></tr><tr><td>20x objective, NA = 0.75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;medium-power objective&quot;)</td></tr><tr><td>60x objective, NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>See &quot;5. Histology&quot; (step 5.15 &quot;high-power objective&quot;)</td></tr></tbody></table>

inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation

Autónoma-célula neuronais funções dos genes podem ser reveladas, causando perda ou ganham de função de um gene em uma população pequena e esparsa de neurônios. Para fazer isso requer gerando um mosaico em que neurônios com perda ou ganho de função de um gene são rodeados por tecido geneticamente imperturbável. Aqui, nós combinamos o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar tecido de cérebro de mosaico que pode ser usado para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. DNA construções (disponível através de repositórios), que codifica para uma etiqueta fluorescente e Cre recombinase, são introduzidos em desenvolver os neurônios corticais que contém genes ladeados com loxP sites nos cérebros de embriões de rato usando utero em eletroporação. Além disso, descrevemos várias adaptações para o método de eletroporação no utero que aumentam a capacidade de sobrevivência e reprodução. Esse método também envolve o estabelecimento de um título para recombinação mediada por Cre em uma população esparsa ou densa de neurônios. Preparações histológicas do tecido cerebral rotulado não exigem (mas pode ser adaptadas para) imuno-histoquímica. As construções utilizadas garantem que fluorescente etiquetado neurônios carreg o gene recombinase Cre. Preparações histológicas permitem a análise morfológica dos neurônios através da imagem latente confocal de mandris dendríticas e axonal e espinhas dendríticas. Porque a perda ou ganho de função pode é feito de tecido mosaico esparsas, esse método permite que o estudo da célula autónomos necessidade e suficiência do gene produtos na vivo.

A única construção GFP. CRE (ver lista de materiais) foi electroporated no E15.5 e visualizado no P14. Dependendo da concentração da construção e do volume de injeção, um resultado esparso ou denso pode ser obtido22,26. Por exemplo, a injeção de 1 µ l de 2 mg/mL GFP. CRE resulta em uma distribuição esparsa de pilhas etiquetadas, alguns dos quais podem ser brilhante (figura 1A) e localizadas na camada II/III (figura 1B). Porque o tecido é de 100 µm de espessura, a maioria dos mandris dendríticas é preservada (Figura 1). Espinhas dendríticas podem ser observadas em ampliações de altas (60 X; A Figura 1). Injeção de 1,5 µ l na mesma concentração resulta em muito densa de rotulagem (Figura 2A) na camada II/III (Figura 2B), que pode ser abaixo do ideal, como é difícil rastrear a fonte de neuritos e espinhas dendríticas (Figura 2). No entanto, ainda é possível a imagem de um neurônio (Figura 2D) e seus processos (Figura 2E), selecionando uma célula brilhante na periferia da área rotulada (Figura 2D).
Finalmente, é possível maximizar o brilho dos neurônios, mantendo uma distribuição esparsa de pilhas etiquetadas. Aqui, a Supernova-GFP (ver lista de materiais) foi electroporated no E15.5 e visualizado no P23. Observe que, com base em observações de tecido cerebral, tiradas em várias idades pós-natal, não parece ser um efeito da idade sobre o brilho de quaisquer construções fluorescentes usado aqui23,24,26. Injeção de 1 µ l de uma mistura contendo 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) e resultados de TRE-Cre 10 µ g/mL em uma distribuição esparsa de células principalmente brilhantes (Figura 3A) na camada II/III (Figura 3B). Processos dendríticas e axonal (Figura 3B) e espinhas dendríticas (Figura 3) podem ser visualizadas. Em nossa experiência, alvejando com qualquer uma construção única como GFP. CRE ou com "Supernova" construções reproducibly renderá expressão em pelo menos 75% dos embriões de electroporated.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig1.jpg"> Figura 1: Dispersos e brilhante expressão depois no utero eletroporação com uma única construção contendo GFP e Cre recombinase. (A) Micrografia de fluorescência baixa ampliação (4x) do córtex cerebral em P23, depois eletroporação no E15.5. (B) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de mancha nuclear DAPI, revelando a laminação cortical (camadas I, II/III, IV e camadas profundas a IV). (C) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de um único neurônio. (D) Micrografia de fluorescência de alta ampliação (60 X) de espinhas dendríticas. Escala de barras = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56675/56675fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig2.jpg"> Figura 2: Densa e brilhante expressão depois no utero eletroporação com uma única construção contendo GFP e Cre recombinase. (A) Micrografia de fluorescência baixa ampliação (4x) do córtex cerebral no P14, depois eletroporação no E15.5. (B) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de mancha nuclear DAPI, revelando a laminação cortical (camadas I, II/III, IV e camadas profundas a IV). (C) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de neurônios na área de rotulagem mais densa. (D) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de neurônios tomadas na periferia da área de rotulagem mais densa. (E) Micrografia de fluorescência de alta ampliação (60 X) de espinhas dendríticas. Escala de barras = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); e 5 µm (E). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56675/56675fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig3.jpg"> Figura 3: Dispersos e brilhante expressão depois no utero eletroporação com Supernova-GFP constrói contendo GFP e Cre recombinase. (A) Micrografia de fluorescência baixa ampliação (4x) do córtex cerebral no P14, depois eletroporação no E15.5. (B) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de mancha nuclear DAPI, revelando a laminação cortical (camadas I, II/III, IV e camadas profundas a IV). (C) Micrografia de fluorescência médio-ampliação (20 X) de um único neurônio. (D) Micrografia de fluorescência de alta ampliação (60 X) de espinhas dendríticas. Escala de barras = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56675/56675fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

11.6K visualizações.  James Madison University. Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Vídeo: Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Indução da Eliminação Proteína Através<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação para definir défices de Migração Neuronal em modelos transgênicos

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Biologia do Desenvolvimento

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Biologia

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Neurociência

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian corticogenesis. This procedure takes advantage of the brain ventricles to allow the introduction of DNA of interest and uses a pair of electrodes to direct the entrance of the genetic material into the cells lining the ventricle, the neural stem cells. This method allows researchers to label the desired cells and/or manipulate the expression of genes of interest in those cells. It has multiple applications, including assays targeting neuronal migration, lineage tracing, and axonal pathfinding. An important feature of this method is its temporal and regional control, allowing circumvention of potential problems related with embryonic lethality or the lack of specific CRE driver mice. Another relevant aspect of this technique is that it helps to considerably reduce the economic and temporal limitations that involve the generation of new mouse lines, which become particularly important in the study of interactions between cell types that originate in distant areas of the brain at different developmental ages. Here we describe a double electroporation strategy that enables targeting of cell populations that are spatially and temporally separated. With this approach we can label different subtypes of cells in different locations with selected fluorescent proteins to visualize them, and/or we can manipulate genes of interest expressed by these different cells at the appropriate times. This strategy enhances the potential of in utero electroporation and provides a powerful tool to study the behavior of temporally and spatially separated cell populations that migrate to establish close contacts, as well as long-range interactions through axonal projections, reducing temporal and economic costs.

Double in utero electroporation allows targeting cell populations that are spatially and temporally separated. This technique is useful to visualize interactions between those cell populations using fluorescent proteins in normal conditions but also after functional experiments to perturb genes of interest.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

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Indução da Eliminação Proteína Através

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical