Name: assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Bu eser Ulusal Sağlık hibe R35 GM118177 PND Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+chemotaxis:+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility,+directional+sensing,+and+polarity.">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li><li>Jeon, T. J., Lee, D. -. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II.">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells.">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis.">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients.">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li><li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt/PKB+during+aggregation.">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li><li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell's+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis.">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li><li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3,4,5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis.">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li><li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration.">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li><li>Nishikawa, M., H&#246;rning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis.">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li><li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization.">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li><li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system.">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves,+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization.">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li><li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility.">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).</li><li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration.">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li><li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+towards+a+paradigm:+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes.">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li><li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation.">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li><li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling.">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li><li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li><li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate.">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li><li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks.">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li><li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants.">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li><li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA.">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li><li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP3-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis.">PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).</li><li>Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemotaxis+in+Dictyostelium.">Analysis of chemotaxis in Dictyostelium.</a> Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum.">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li><li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2/3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells.">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li><li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells.">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li><li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Akt/PKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium.">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li><li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations.">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yöntem tanımlamak burada nüfus ve tek hücre davranış yanıt akışı yamultmak için değerlendirmek için kullanışlı bir yol sunar. Önceki çalışmalarda lider ve kenar işaretleri geçiş sırasında geri kalmış yerelleştirme analiz ederken, önemlisi, güncel yaklaşımlar ilk etkisi soruşturma akut kesme akışı uygulayarak sağlar. Bu yöntemi kullanarak aslında, ilk yanıt akışı yamultmak için hücre hücre geçiş gerektirmez, gösterdi. Bunun yerine, ilk kesme akışı uyarana hızlı ve geçici yanıt akışına benzer şekilde chemoattractant degradeyle görülen ilk küresel yanıt yamultmak için uzun süreli pozlama ile görülen yönlü geçiş önce gelir.
Her yöntemin farklı avantajları ve dezavantajları olsa bile biyokimyasal ve mikroskobik yaklaşımlar tamamlayıcı veri verim. Stimülasyon ardından hücre lizis ve immunoblotting PKBs, KrsB ve ERK, örneğin, hücre tüm bir popülasyon analiz eder ve böylece tek hücre davranış inceliyor bir tahlil aksine hücre hücre varyasyon ortalama. Ancak, nüfus tabanlı deneyleri maskesi ince değişiklikleri tek tek hücreler analiz ederek kolayca görülebilir hücre davranış eğilimindedir. Ayrıca, burada açıklanan biyokimyasal tahlil sadece daha sonra ele alınacak nedenlerle toplama yetkili hücreleri ile etkili olur. Buna ek olarak, RBD, RalGDS, PH-Crac, kireçΔcoilve PTEN, relocalization mikroskobu tabanlı tahlil Örneğin, korteks ve sitozol arasında bitkisel ve toplama yetkili hücreler için etkili ve böylece gözlemler için izin verir Bu kutuplaşma değişen derecelerde sahip hücrelerin genel olarak geçerlidir. İki yaklaşım tamamlayıcı kılan farklı kümeleri kullanılabilir satır aralığı/ahşap kaplama kenar işaretleri, böylece kesme akışı tahlil ile test sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları kapsamı genişleyen incelemek gerçektir.
Çok sağlam mikroskobu tabanlı deneyleri içinde yanıt, bitkisel hücre, hücre lizis ve immunoblotting ardından uyarılması için yanıt vermeyen bu yüzden belirsizdir. Bir ihtimal plaka döndürüldüğünde hücrelerine uygulanan kesme kuvvet miktarı akış odası hücrelerde yaşadığı kuvvet eşleşmiyor. Gelişmiş hücre, buna ek olarak, harekete geçirmek için daha düşük bir eşik var ve, böylece, her iki koşul altında yanıt. Bu olan faaliyet biyokimyasal tahlil tarafından ölçülen biyosensörler değil ifade edilir veya folik asit içeren bitkisel hücrelerin uyarılması PKBR1/PKBA ve ERK2 sağlam harekete geçirmek yol açar bu yana bitkisel hücrelerde etkinleştirilmemesini düşüktür (veri değil gösterilen). Ayrıca, bitkisel hücreleri PIP3 birikimi yansıtır, PH-Crac açık işe alım mikroskobu tabanlı assay olarak gösterir. PKBA işe de PIP3 üzerinde bağlı olduğundan, biyokimyasal tahlil koşullarda yukarıda da belirtildiği gibi en uygun olmadığınız sürece, PKBA akut mekanik uyarmaya cevap değil zor görünüyor. Bu araştırma bir alan kalır.
Kemotaksis düzenleyiciler biyokimyasal analizini kafein deneme boyunca varlığını gerekli. İlk kafein kampı salgılanması nedeniyle hücre-hücre sinyallemesi önlemek için eklendi. Ancak, görünüşe göre ACA boş hücreler hala kafein PKBR1 fosforilasyon yanıt için gerekli bu yana kafein akut mekanik uyarmaya gozlemler cyclase (ACA) inhibisyonu yanı sıra başka bir rolü vardır. Kafein daha önce TorC2 etkinliği26blok gösterilmiştir. TorC2 inhibisyonu hücrelerin Bazal bazı hareketliliği bloke ve böylece PKBR1 Bazal aktivasyonu ve diğer bileşenleri sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağların indirdi mümkündür. Düşük Bazal etkinlik akışı yamultmak için yanıt gözlemlemek için şart. Aslında, ne zaman hücre geliştirme sırasında önceki zaman noktalarda toplanmıştır, artan Bazal etkinliği ve düşük kesme akış indüklenen tepki göstermek. İlginçtir, bu bitkisel hücrelerin orantılı olarak daha fazla PKBA etkinliği ve kıyasla daha az PKBR1 hücreleri31geliştirilen bilinmektedir. Bu eksikliği bir biyokimyasal tahlil bitkisel hücrelerinin daha fazla katkıda Bazal devlet bitkisel ve toplama yetkili hücrelerinde biraz farklı şekilde düzenlenmiştir mümkündür. Hücreleri gelişiminin sonraki noktalarda toplanmıştır, merakla, onlar da azaltılmış bir yanıt, polarite yerelleştirme üzerinde güçlü etkisi ve bu tahlil incelendiğinde çeşitli kemotaksisi düzenleyiciler aktivasyonu nedeniyle büyük olasılıkla vardı.
Stimülasyon hücrelerinin mikroskopisi odası hem güç hem de uyarıcı süresi maksimal yanıt22' ye katkıda saptandı. Eğer uzun bir süre için uygulanan diğer bir deyişle, maksimal yanıt bile bir düşük kesme güçle elde edilebilir (10 s 2 karşı s). Bu gözlem ilk geçiş akış kaynaklı yamultmak için yol açar bir sürekli ama zayıf, uyarıcı maruz kalır neden hücreleri bir ilk küresel yanıt var açıklar. Geçerli aparatı ile aralığın alt ucundaki araştırmak için yeterince düşük kesme akışı oluşturmak koyamadık.
Belki de akut mekanik stimülasyon kullanılarak yürütülen çalışmaların en önemli dolaylı mekanik ve kimyasal uyaranlara ortak sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağlar beslemek için görünür olduğunu. Biz iki uyaranlara için mekanik stimülasyon toplu arabellek eklenmesini kullanarak entegre olsa da, gelecek çalışmalar nerede chemoattractant hızla çok daha çok yönlü olacak akışı aracılığıyla kanal, teslim edilebilir bir sistem geliştirmek amacı olacak ve mekanik ve kimyasal uyaranlara entegrasyonunu değerlendirmek için güçlü bir şekilde. Chemoattractant akışı huzurunda teslim edilmek üzere olduğu için ne yazık ki, geçerli iki satırlık Kurulumu kullanarak chemoattractant ikinci bir makaslama akışını uyarıcı ile ilişkili ektir. Bir alternatif için kamp Westendorf ve arktarafından başarılı bir şekilde gösterildi lazer uyarılmış sürümünden bir chemoattractant Kafesli habercisi olabilir. 32. gelecekte, aynı zamanda entegrasyon diğer uyaranların incelemek, örneğin, akış ve değişken elektrik alanları kesme veya akış ve değişken yüzey sertliği yamultmak için ilginç olabilir. Mekanik stimülasyon, iki tür içerir ilk sinyalinin alınmasına aralarında farklı olabilir, ancak ikinci örnek ilginç çünkü. Yönlendirilmiş göç teşvik tüm uyaranlara aynı sinyal iletim ağ paylaşmak ve sadece nasıl uyarıcı algılanmaktadır içinde değişir teyit hücreleri karmaşık ortamlarda nasıl gezinebileceğiniz açıklar. Son olarak, biz zaten kesme akışı ile akut stimülasyon insan nötrofil benzeri hücreleri22yaymak için yol gösterdi. Yapılacak çalışmalar daha fazla Yerelleştirme ve sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağları ile memeli hücrelerinde mekanik uyaranlara çeşitli bileşenlerini aktivasyonu muayene edecektir.

Geçiş ökaryotik hücre ortamında gradyanlar çözünür veya yüzey bağlı chemoattractants, değişken sertliği yüzeylerde, elektrik alanları veya yamultma akışı dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları tarafından önyargılı. Moleküler mekanizmalar kemotaksisi sürüş bizim anlamada birçok gelişmeler rağmen daha az yönlendirilmiş göç ve nasıl bu farklı sinyaller Birleşik bir üretmek için hücresel düzeyde entegre edilmiştir diğer türleri hakkında bilinen göçmen yanıt.
Geçiş doğru bir chemoattractant artan bir konsantrasyon içerir üç davranış bileşenleri Yönetmen: hareketliliği, yönlü algılama ve polarite1. Motilite pseudopod çıkıntı tarafından elde hücrelerin rastgele hareket anlamına gelir. Yönlü bir hücre bir chemoattractant kaynağını tespit yeteneği algılama, hangi hatta oluşabilir hücrelerin immobilize. Polarite hücre içi bileşenler arasında önde gelen ve artan sebat hareketine yol açan bir hücrenin, ahşap kaplama kenarı daha istikrarlı asimetrik dağılımı gösterir.
Bir chemoattractant hücresel yanıt dört kavramsal olarak tanımlanmış düzenleyici ağları faaliyete bağlıdır: reseptör / G protein, sinyal iletimi, aktin sitoiskeleti ve polarite1. G protein birleştiğinde reseptör Chemoattractant bağlama heterotrimeric G protein α ve βγ yönlü sinyali güçlendirir aşağı akım sinyal iletim ağ üzerinden sinyal iletir. Birden çok sinyal iletim ağı içinde paralel olarak hareket ve önyargı aktin polimerizasyon ve bunun sonucunda pseudopod çıkıntı, degradenin yönünü aktin sitoiskeleti ağa beslenir. Ras GTPazlar, TorC2, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), fosfataz ve tensin homolog (PTEN) ve guanylyl cyclase kemotaksisi önemli düzenleyiciler arasında vardır. Geri bildirim mekanizmaları sinyal iletim ağı içinde ve arasında sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağları daha fazla yanıt yükseltmek. Son olarak, kötü tanımlanmış polarite ağ giriş aktin sitoiskeleti alır ve daha fazla kalıcı degradenin yönünü geçişinde yaymak için sinyal iletim şebeke önyargıları.
Mekanik anlayışımızı kemotaksisi çoğunu fluorescently öğesini biyosensörler düzenleyici ağların çeşitli bileşenleri için gelişimi nedeniyle mümkün yapıldı. Birçok kemotaksisi düzenleyiciler asimetrik bir dağıtım düzenleyici molekül veya faaliyet var. Örneğin, tanımak biyosensörler harekete geçirmek yorum-in küçük GTPases Ras ve Rap1-Raf1 (RBD burada anılacaktır) Ras bağlayıcı etki ve RalGDS, sırasıyla-öncü bir chemotaxing hücre2,3yerelleştirilmesine. Benzer şekilde, PI3K ve onun ürün phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), pleckstrin homoloji (PH) etki alanı tarafından tanınan da göstermek yerelleştirme ön cep4,5. Buna ek olarak, bir 3-fosfataz PTEN hangi dönüştürür PIP3 geri phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, hücre6ahşap kaplama kenarı yerelleştirir. Önemlisi, bu biyosensörler onların yerelleştirme yanıt küresel stimülasyon ile bir chemoattractant olarak değiştirin. Sitozolik ya da çıkıntılar resting hücredeki ipucu, kortikal Yerelleştirme ve bulunmadığına kenar işaretleri geri kalmış ise korteks için relocalize öncü işaretleri çıkıntılar resting hücrede ipuçları, sonra sitozolik haline uyarım. Biyoalgılayıcı dağıtım yanıt olarak bir chemoattractant ile küresel stimülasyon analizi katkı kez gözlemleri yıkmak hareketliliği ve polarite, en aza indirir. Bir chemoattractant ile bir hücre süspansiyon genel veya üniforma uyarılması da bir araç olarak protein harekete geçirmek, genellikle protein fosforilasyon7,8,9 tarafından algılanan nüfusu genelindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan . Mikroskopi düzenleyici ağların çeşitli bileşenlerinin davranışı hakkında zamansal ve mekansal bilgi toplamak için kullanılan, ancak bu biyokimyasal tahlil öncelikle geçici bilgi, elde etmek için kullanılır.
Sinyal iletim ağ bir telaşlı sistem10,11özellikleri içerir. Supra-eşik kemotaktik uyaranlara yanıt "yaparak" ve ateşe dayanıklı dönemleri görüntülemek. Yanıt-e doğru da stochastically tetiklenir ve salınım davranış gösterebilir. Sinyal iletim olaylar dalgalar12,13,14,15yaymak bölgelere korteksin lokalizedir. Ön ya da geri, işaretçileri için işe veya aktif bölgelerinden yayılıyor dalgaların, ayırmak. Onlar karşılamak üzere active bölge izleyen ateşe dayanıklı bölge nedeniyle karşılıklı yönlendirilmiş dalgalar yok edin. Yayılıyor sinyal iletim dalgalar altında yatan hücre göç10arabuluculuk hücresel çıkıntılar.
Benzer düzenleyici mekanizmaları da nötrofil ve diğer memeli hücre türleri16 uygulanabilir olmasına karşın kemotaksisi olarak yukarıda belirtilen bilgilerin çoğunu sosyal amip Dictyostelium discoideum, iyice düşünülmüş--dan geldi . Dictyostelium tek hücreleri binlerce sonunda sporları içeren çok hücreli bir meyve vücut şekillendirme bir toplama merkezine doğru geçirirken, sırasında şiddetli açlık, güçlü kemotaktik tepki süresine sahip bir iyi kurulmuş model organizmadır. Bakteriyel gıda kaynakları bulmak için bu organizmanın tek hücre büyüme aşamasında kemotaksisi esastır. Önemlisi, geçiş tek Dictyostelium hücre memeli nötrofiller veya metastatik kanser hücrelerinin, Bütün bunlar çok hızlı protozlar türü göç geçmesi geçiş oldukça benzer. Aslında, düzenleyici ağların genel topoloji, hem çok bireysel sinyal iletim yollarının kemotaksisi dahil korunmuş Dictyostelium ve memeli lökosit17arasında. Ayrıca, fibroblastlar gibi diğer hücre reseptör tirozin kinaz (RTK) yerine GPCRs kullanın; Ancak, RTKs-ebilmek beslemek benzer ağlar.
Kemotaksis aksine, yönlendirilmiş göç çeşitli modları sürücü sinyal mekanizmaları konusunda eksiksiz bilgi bulunmuyor. Benzer şekilde chemoattractant Gradyanda geçiş hücreleri için çeşitli çalışmalarda harekete geçirmek ve/veya yerelleştirme tipik öncü işaretleri, aktin polimerizasyonu, PIP3 ve/veya hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) 1/2, dahil olmak üzere, bildirdin Açık geçiren hücre göç akışı veya elektrik alanları18,19,20,21değişimler yamultmak için yanıt olarak yönetti. Ancak, bu çalışmalarda uyarıcı sürekli maruz Ayrıca hücre göç, örneğin, bir uyarana tepki olarak özellikle öncü işaretleri yerelleştirilmesine, veya sadece öncü yerelleştirmek soru açık bırakarak sonuçlandı pseudopods ön geçirme hücre sayısının artmasına yüzünden.
Hücreleri cevaben kesme akışı hem düzeyinde nüfus ve tek tek hücreler22olarak teslim akut mekanik pertürbasyon gözlemlemek için bize izin deneyleri geliştirdik. Benzer bir chemoattractant, akut yaptığı ile küresel stimülasyonTion kesme akışı ile hareketliliği veya polarite mekanik bir uyarana karıştırıcı katkısı olmadan bir hücresel yanıt çalışma sağlar. Bu biyokimyasal ve mikroskobik deneyleri genetik veya farmakolojik tedirginlikler ile birleştirerek hakkında nasıl mekanik uyaranlara algılandığını öğrenmek için bize izin verir ve iletilen. Ayrıca, bu yaklaşım da yokluğunda böylece sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları reseptör/g izole eden bir chemoattractant, chemoattractant reseptör sistemi aşağı faydalanarak için yeni bir yöntem sağlar protein ağ.
Son zamanlarda biz açıklanan teknikleri kullanarak akut kesme stres kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar22birden çok bileşeni etkinleştirme için yol gösterdi. Akut mekanik uyarıcı değişen aralıklarla uygulayarak, biz aynı şekilde chemoattractants için mekanik bizi canlı tutan da altında yanıt yaparak davranışını da dahil olmak üzere bir telaşlı sisteminin özelliklerini sergileyen, gösterdi koşullar ve ateşe dayanıklı bir süre varlığı doyurarak. Son olarak, mekanik ve kimyasal uyarımı birleştirerek iki uyaranlara büyük olasılıkla birden çok uyaranlara karşı önyargı hücre göç entegrasyon için izin sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar, paylaşmak gösterdi.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td></tr><tr><td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Use to grow &lt;em&gt;K. aerogenes&lt;/em&gt; (step 2.1.1), and to basalate and stimulate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td></tr><tr><td>10 cm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Use to count &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells (step 2.1.2)</td></tr><tr><td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt;cells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td></tr><tr><td>Polystyrene cup (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Use to stimulate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td></tr><tr><td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Use to deliver mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td></tr><tr><td>Slide with a channel (&amp;mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td></tr><tr><td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td></tr><tr><td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td></tr><tr><td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td></tr><tr><td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used to image &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td></tr><tr><td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&amp;times;/1.25&amp;ndash;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>An alternative used to image &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells (step 4.1.4)</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D and 5192000027</td><td>Use to deliver mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td></tr><tr><td>Micropipette (Femtotip; 1 &amp;mu;m outside diameter, 0.5 &amp;mu;m inside diameter )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Use to deliver mechanical stimulation to &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells by a micropipette (step 4.3)</td></tr><tr><td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td></tr><tr><td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td></tr><tr><td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Use to plate &lt;em&gt;D. discoideum&lt;/em&gt; cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td><td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td></tr><tr><td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td><td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td></tr></tbody></table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

Kemotaksis, ya da bir chemoattractant kadar Degrade geçiş en iyi anlaşılmış, yönlendirilmiş geçiş modudur. Sosyal amip kullanarak çalışmalar ortaya Dictyostelium discoideum paralel yollar karmaşık sinyal iletim ağı chemoattractants cevaben güçlendirir ve önyargılı aktin polimerizasyon ve çıkıntı bir pseudopod yol açar degradenin yönünü. Buna ek olarak, diğer türleri, örneğin, yönlendirilmiş göç akışı veya elektrik alanları, yamultmak için maruz kalma nedeniyle sürüş moleküler mekanizmaları bilinmemektedir. Kemotaksis birçok düzenleyiciler, yerelleştirme ya da harekete geçirmek bir chemoattractant ile küresel stimülasyon sonrasında geçici değişiklikler gösterir yanı sıra, yerelleştirme önde gelen veya geçirme bir hücrenin ahşap kaplama kenarı sergilemek. Moleküler mekanizmalar yönlendirilmiş göç diğer türleri anlamak için hücresel yanıt-e doğru akış yamultmak için kısa (2-5 s) pozlama dayalı akut mekanik stimülasyon incelenmesi sağlayan bir yöntem geliştirdi. Bu uyarımı hücreleri tek hücre davranışı incelemek için biyosensörler fluorescently etiketli ifade görüntüleme sırasında bir kanal olarak teslim edilebilir. Ayrıca, hücre nüfus bir tabak, lysed ve immunoblotted ilgi proteinlerin etkin versiyonlar tanımak antikorları kullanarak teşvik. Her iki deneyleri birleştirerek, bir moleküller hücre altı Yerelleştirme ve/veya fosforilasyon değişikliklerden aktif geniş bir dizi inceleyebilirsiniz. Bu yöntemle akut mekanik stimülasyon kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları aktivasyonu tetikler belirledi. Başlatan olaylar kesme akış kaynaklı hareketliliği için gerekli anlamak için önemli hücresel yanıt akut mekanik uyarılması için incelemek için yeteneğidir. Bu yaklaşım da kemotaktik sinyal iletim ağ chemoattractant reseptör karıştırıcı etkisi olmadan çalışmak için bir aracı sağlar.

Zamansal kemotaksisi düzenleyiciler cevaben akut mekanik stimülasyon
D. discoideum hücre mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için yapisan toplama yetkili hücreleri için kesme akımı nabız kısa maruz bırakıldı. Toplama yetkili D. discoideum hücreler hücreleri komşu tarafından hissedilen kampı salgılar. Hücre-hücre sinyallemesi katkı üstesinden gelmek için hücreleri gozlemler cyclase D. discoideum içinde engeller ve böylece kamp salgı28kafein ile tedavi edildi. Nitekim, hücreleri ile önceden tedavi kafein PKBR1 ve ERK2 çok düşük Bazal etkinlik vardı ve 5 s stimülasyon kesme akışı (şekil 1A) ile takip bu kinaz anahtar kalıntılarının fosforilasyon sağlam bir artış gösterdi. Yanıt geçici ve bitkin çevresinde 10-15 s PKBR1 için ve çevresinde 30 s ERK2 için benzer şekilde için daha önce yayınlanan bu proteinler chemoattractant7ile aktivasyonu için bulgular.
Tek başına (veya bir araçla) için düşük Bazal düzeyi, bu testin geliştirilmesi için ön çalışmalar dikkate alınarak yanıt verimliliğini değerlendirmek zordur stimülasyon kesme akışı ile karşılaştırıldığında yamultmak akışı varlığı bir chemoattractant kampı (şekil 1B). Bu analiz bir artış yanıt akışı yamultmak için sinyal iletim ağ yanıt doymuş olduğunu düşündüren cAMP ile belli etmedi. Her ne kadar bu tahlil PKBR1 fosforilasyon kampı artmamıştır, hücrelerin yanıt-e doğru chemoattractant toplama yetkili hücre süspansiyon, saklandığı bir standart stimülasyon protokolü kullanarak cAMP ile uyarılmış ve çeşitli lysed görülebilir stimülasyon takip zaman puan. Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi bu koşullar altında orada PKBR1 fosforilasyon yanıt chemoattractant ama değil araç olarak geçici bir artış olur. En yüksek yanıt 30'görülmektedir çünkü hücre Süspansiyon sırasında tahlil sıcaklığını ~ 9 ° C, s Bu tahlil karşılaştırıldığında ~ 22 ° c26açıklanan mekanik stimülasyon tahlil için.
Önde gelen ve kenar işaretleri akut mekanik uyarılması için ahşap kaplama kronolojik zamanmekansal yanıt
Yukarıdaki nüfus tahlil yalnızca kemotaksisi düzenleyiciler davranışı hakkında geçici bilgi sağladığı hücreleri de bir mikroskopla gözlenen süre için kısa bir mekanik uyarıcı maruz bırakıldı. Bu tahlil toplama yetkili veya bitkisel gerçekleştirilebilir D. discoideum hücreleri olan yerelleştirme hücrelerdeki bir chemoattractant ile uyarılan tanımlanmış çeşitli fluorescently etiketli biyosensörler ifade. Hangi PIP3 veya yeni polimerli aktin tarafından işe alınan, iki öncü işaretleri, PH etki Crac ve kireçΔcoil, her ikisi de çoğunlukla sitozolik yerelleştirme resting hücrelerinde daha önce raporlanmış (şekil 2Aolarak, tamamlayıcı film 1 gösterdi )4,29. Basally aktif olan hücrelerde, bu biyosensörler pseudopods ipuçları üzerinde görülebilir. Stimülasyon 2 için kesme akışı ile takip s, hızla bir zirve ~ 6-10 ile korteks relocalized biyosensörler s ve için sitozol ~ 30 tarafından döndürülen s. Buna ek olarak, bir ahşap kaplama kenarı marker PTEN korteksi uyarımı (şekil 2A) önce yerelleştirilmiş. Sonra kısa darbe kesme akışı ile sitozolik PTEN yoğunluğu, daha yavaş dynamics da olsa için öncü biyosensörler artmış. Biyoalgılayıcı yerelleştirme sitozol üzerinden bir değişiklik korteks ve tersi, açıkça bir değişiklik olarak yanıt basit miktar için izin sitozolik yoğunluğu görülmektedir.
Biyosensörler akut mekanik stimülasyon karşılık olarak gözlenen davranış lider ve kenar yerelleştirme dynamics stimülasyon tek tip chemoattractant ile karşılık olarak ahşap kaplama ile tutarlıdır. Bu davranış gösterilen üç biyosensörler benzersiz değildi. Yerelleştirme önceden yayınlanmış, benzer değişimler de öncü işaretleri RBD ve RalGDS tespit edildi gibi hangi tanımak Ras ve Rap1, sırasıyla, hem de başka bir ahşap kaplama kenarı işaret CynA22,30gelince aktif.
Benzer bir tahlil çeşitli inhibitörleri etkilerini değerlendirmek için bir basit değişiklik deneysel Kur üzerinden tek bir giriş satır için bir çift biri tarafından kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, hücreler ilk denetim koşullara maruz ve sonra istediğiniz test aracısı içeren arabelleği değiştirdim. Örneğin, aktin depolymerizing uyuşturucu LatA ilavesi RBD yanıt bloke yanı sıraΔcoil, akut mekanik stimülasyon (şekil 2B) için kireç.
Küresel yanıt hücre geçiş kesme akışı ile uzun süreli stimülasyon altında önce gelir.
Burada açıklanan yaklaşım da D. discoideum geçiş kesme akışı etkilerini çalışmaya adapte olabilir. Aslında, akış 2 sonra Kapat değil Eğer s ancak kaldı üzerinde deneme süresi için bitkisel hücre gösterdi yönetmen geçiş akış (şekil 3tamamlayıcı film 2) karşı. Bu göçmen bir yanıt temin gerekli kesme akışı (örneğin, 2B şekilgörüldüğü gibi) bitkisel hücrelerde akut stimülasyon ile küresel bir yanıt elde etmek için genellikle kullanılan basınç daha düşük olması gerekmektedir. Bununla birlikte, bile daha düşük basınçta, hücreleri sağlam bir üniforma yanıt hücrenin bulunduğu herhangi bir değişiklik öncesinde kireçΔcoil yerelleştirme, bir değişiklik göre ölçülen görüntülenir. Böylece, bu deneyler açıkça 1) küresel yanıt hücre harekette bağlı değildir ve 2) küresel yanıt yönlendirilmiş geçiş öncesinde gösterdi.
Akut mekanik stimülasyon yanıt test alternatif yaklaşımlar
Bir akış yoluyla odası kullanımı akut mekanik stimülasyon yanıtı incelenmesi için net avantajları olmasına rağmen biz de tek tek hücreler tepki için akut mekanik stimülasyon testi için iki ek deneyleri geçerliliği. Şekil 4' te gösterildiği gibi bir micropipette (şekil 4A) tarafından teslim veya toplu kullanarak el ile tampon bolus eklenmesi tarafından hücreleri uyardığında hızla ve geçici sitozol korteks için yeniden lokalizeΔcoil kireç Arabellek ek bir pipet (şekil 4B) ile. Bu açık bir dezavantaj bu deneyleri her iki hücreye teslim kesme Kuvvetleri tam miktarı bilinmiyor ve kolayca değişmeyen olduğunu belirtmek gerekir. Ancak, nerede mekanik ve kimyasal uyaranlara arasında geçiş isteniyorsa durumlar için toplu arabellek ek akışı aygıtın uyarılması için sağlam bir alternatif sunuyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig1.jpg"> 
Şekil 1: temsilcisi akut mekanik veya kimyasal uyarmaya yanıt D. discoideum hücre biyokimyasal değerlendirilmesi için sonuç. Toplama yetkili hücreleri mekanik veya kimyasal uyaranlara maruz kaldılar, belirtilen süre noktalarda lysed ve tanımak antikorları kullanarak immunoblotted fosforile PKBR1 veya ERK2. (A)yapışık hücreleri uyarılmış bir orbital Çalkalayıcı 5 üzerinde s. Membran Coomassie parlak mavi (eşit protein yükleme göstermek için CBB ile) lekeli. (B) yapışık hücreleri yaklaşık 5 s aşağıdaki için çapraz bir şekilde plaka manuel hareketi tarafından teşvik nedeniyle ek 1 µM kamp veya arabellek (araç) veya herhangi bir kimyasal stimülasyon (-) olmadan kimyasal uyarımı. İki immunoblots 0 zamanında gördün PKBR1 Bazal aktivasyonu varyasyon kapsamını gösterir. Zaman zaman, PKBA harekete geçirmek de bu tekniği ile alt panelinde gösterildiği gibi tespit edilemedi. (C) süspansiyon hücreleri 1 µM kamp veya arabellek (araç) ile teşvik. Bu rakam bir parçası (A) Artemenko ve arkdeğiştirildi. (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56411/56411fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig2.jpg"> 
Şekil 2: temsilcisi sonuçları akut mekanik stimülasyon ve mikroskop üzerinde tek hücre canlı görüntüleme için. (A)toplama-yetkili D. discoideum hücreleri ifade RFP öğesini kireçΔcoilveya GFP öğesini PH-Crac veya PTEN uyarılmış tek yönlü laminar akış 15 dyn/cm2 ile 2 s. imge were-5 her 3 toplanan için s . Biyosensörler translocation mekanik stimülasyon karşılık olarak gösterilen temsilcisi hücreleri gösterilir. Korteks, her Biyoalgılayıcı birikimi olarak zaman 0 için normalleştirilmiş ortalama sitoplazmik yoğunluğunun tersini sayısal. 18 (kireçΔcoil), 20 (PH-Crac) veya 6 (PTEN) hücrelerin ortalama yanıt gösterilir. Değerleri RFP öğesini kireçΔcoilifade SE. (B) bitkisel bir hücre ± anlamına - RFP ve GFP öğesini RBD tedavi araç veya 5 mikron ile en az 15 dakika ve o zaman tek yönlü laminar akış 41 dyn/cm2 2 ile uyarılan LatA s. görüntüleri toplanan her 3 RBD-GFP s. ve kireçΔcoil- RFP birikimi korteks, (Aolduğu gibi) sayılabilir. Ortalama ± SE değerlerdir. Analiz hücre sayısı her koşul gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu rakam Artemenko ve ark. değiştirildi (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56411/56411fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig3.jpg"> 
Şekil 3: Temsilcisi akışı ile uzun süreli uyarılması için D. discoideum hücreler yanıt için sonuç. (A)bitkisel hücrelerinΔcoil sürekli tek yönlü laminar akış 15 dyn/cm2 sinin ve her 3 s. parça 11 hücre görüntüsü RFP öğesini kireç ifade (B) gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu rakam Artemenko ve ark. değiştirildi (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56411/56411fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig4.jpg"> 
Şekil 4: temsilcisi sonuçları için alternatif yaklaşımlar tepki için akut mekanik stimülasyon testi. (A)bitkisel D. discoideum hücreleri ifade RFP öğesini kireçΔcoil basally tahlil arabellek yavaş bir hızda serbest micropipette (*) maruz. Akış hızı kısa bir artış 0 zamanında bir bolus tahlil arabelleği hızlı teslimat tarafından sağlanır. Görüntüleri toplanan mikroskobu odası küçük bir düşüş olarak kaplama RFP öğesini kireçΔcoil ifade her 3 s. (B) bitkisel D. discoideum hücreleri mekanik olarak arabelleğe büyük miktarda eklenmesi tarafından teşvik odası. Görüntüleri toplanan her 3 ölçek s. bar = 10 µm. bölüm(a)bu rakamın modifiye edilmiştir Artemenko vd. (2016) 22. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56411/56411fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film 1: Akut mekanik stimülasyon kireçΔcoilhızlı ve geçici translocation tetikler bu biyosensörler ifade hücreleri - RFP veya toplama yetkili D. discoideum korteks için PH-Crac-GFP üzerinden sitozol. Tek yönlü laminar akış döndü için 5 s zaman 0 ve hücreleri 3 s aralıklarla görüntüsü. Kayıttan yürütme hızını 5 kare/sn olduğunu. Her hücre satırı için iki örnek gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu film şekil 2A için karşılık gelen ve Artemenko ve ark. değiştirildi (2016) 22. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_1_060417.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı film 2: Sürekli mekanik stimülasyon kireçΔcoilhızlı ve geçici translocation tetikler RFP - sitozol üzerinden geçiş hücre akışının yönü karşı önce korteks için. Bitkisel hücrelerin kireçΔcoilifade - RFP 0 zamanında başlayan 15 dyn/cm2 sürekli shear strese maruz ve 3 s aralıklarla görüntüsü. Kayıttan yürütme hızıdır 10 kare/s. ölçek 10 µm çubuk =. Bu film şekil 3 ' e karşılık gelir ve Artemenko vd. daha önce yayımlanmış olan (2016) 22. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_2_060417.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation at JoVE.com

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

assessment-dictyostelium-discoideum-response-to-acute-mechanical

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

6.9K Görüntüleme.  SUNY Oswego. Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Video: Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genetik

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Davranış

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Tıp

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Biyoloji

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

Vitro Sıçanlarda kolon Afferent liflerinin Elektrofizyolojik özellikleri karakterizasyonu

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Nörobilim

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Toplama Tahliller

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler