Name: studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging at JoVE.com

The authors have no Acknowledgements.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> büyüyen hücreler <ol><li> D. büyümek doku kültür plakaları içinde ışık altında 23 ° C de AX ortam içinde discoideum hücreleri. % 75 confluency üzerinde yüksek yoğunluklarda hücreleri tutmaktan kaçının. NOT: Optimal yanıtı sıcak stresine için, hücreler üstel büyüme fazında olması gerekir ve sabit faz ulaşmış olmamalıdır. </li><li> Görüntüleme önceki gün, 1 x 10 4 hücre / ml, alçak flüoresans ortamı (LFM) bölünmüş hücreleri. NOT: Bu adım, AX maddeden kaynaklanan arka plan floresan azaltmak gereklidir. Kuluçka süresi, 2 saat, en az azaltılabilir. Bununla birlikte, AX ortam içinde alınmış veziküller de 2 saat sonra bir arka plan sinyali üretir. </li></ol></li><li> Mikroskopi için hazırlanıyor hücreler <ol><li> görüntüleme önce, LFM doku plaka hasat hücreleri ve cam alt yemeklerin içine hücrelerin yeterli sayıda aktarın. NOT: Genellikle,1 x 10 5 hücre / ml yeterlidir; deney düzeneği (8 saat daha uzun) uzun görüntüleme dönemleri gerektiriyorsa, ancak, hücre sayıları dikkatle D. olarak, ayarlanması gerekebilir diskodeyum hücreleri gelişimsel döngüsü geçiş ve besin düşük ise hücre sayıları yüksek olup olmadığını akarsu ve agrega başlayacaktır. </li><li> Hücreler 20 dakika yerleşmek için izin verin. dikkatle taze ortam ile kullanılan ortamının değiştirilmesiyle olmayan yerleşmiş hücreleri çıkarmak. </li></ol></li></ol> 2. Görüntüleme NOT: protokol geniş alan sistemlerinin yanı sıra konfokal mikroskopi kurulumları kullanılabilir. hedefleri içeren ısı kontrollü bir inkübasyon kutusu ve mikroskop aşamasının kullanımı yararlı, henüz sıcaklık kontrolü için gerekli değildir. Isı stresi gerçekleştirilirse, inkübasyon kutusunun sıcaklığı 40 ° C&#39;ye kadar, deney, örneğin, kullanılan yüksek sıcaklığa ayarlanır. Aksi takdirde, sıcaklık 25 ° C olarak ayarlanır6 ° C. Sıcaklık değişimleri görüntüleme sırasında sıcaklık değişimleri odağını etkiler gibi, sistem uyum sağlamak için önceden yapılmalıdır. Not: görüntüleme sırasında, sıcaklık soğutma odası kullanılarak kontrol edilir. olmayan vurguladı hücrelerin görüntüleme için varsayılan sıcaklığı 23 ° C dir. Isı stresi koşulları için, sıcaklığı istenilen seviyeye buna göre artar. Soğutma odasındaki piezo elemanı sıcaklık kayması çok çabuk cevap verebilir. Ancak, görüntülerin odak (sıcaklık kayması bağlı en fazla 20 mm sapma olabilir) hafifçe değişecektir. kullanılan mikroskop donanım, oto-fokus ile donatılmış sürece Böylece manuel refocusing, görüntü alımı ilk dakika içinde gereklidir. <ol><li> Olmayan vurguladı koşullarda görüntü elde etme <ol><li> 23 ° C&#39;de olmayan stresli koşullar altında görüntü hücreleri, bakış 6 alanlara (FOVs) en az kazanır. NOT: Non-stres koşulu visualiz olabilired temsilcisi hareketsiz kısa bir zaman atlamalı (5-30 dk) ya da satın alma kaydederek ya. Her koşul veya hücre hattı için görüş 6 alanlara (FOVs) en az kazanır. NOT: tek tek hücrelerin ilgi durumunda, FOV ortasında ilgili hücreleri konumlandırmak ve ortada ilgi hücreleri içeren FOV ile bir 3 x 3 kiremit serisi kayıt D.. diskodeyum hücreleri hareketli ve FOV dışarı göç olabilir. Ancak, 3 x 3 karo serisi potansiyel ilgi hücre tarafından keşfedilmeyi alanını arttırır ve ~ 6 saat zaman atlamalı dönemler için izlenebilir kalır. </li><li> Hücrenin tüm hacmini yakalamak için 1-0,25 mikron adımda maksimum 7 mikron z-yığınları elde edin. </li><li> hücrelerin toplam sayısını değerlendirmek için bir referans parlak bir alan görüntü kazanır. </li></ol></li><li> Isı stresi için görüntü elde etme <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak 30 ° C&#39;ye kadar soğutma odası sıcaklığı ayarlayın. &lt;/ Li&gt; <li> sıcaklık göstergesi, istenen değere ulaştıktan sonra, parlak bir alan kanalda elle yönlendirmesi ve time-lapse başlamadan önce kaydedilen tüm FOVs kontrol edin. </li><li> zaman noktaları arasında, 5-10 dakikalık bir zaman aralığı ile bir ısı stresi 4 saat bir zaman atlamalı başlatın. Doğru İlk iki zaman noktası alımı sırasında odaklama için kontrol edin. </li></ol></li><li> Kurtarma sırasında Görüntü edinimi <ol><li> Isı stresi sonra, geri 23 ° C&#39;ye kadar sıcaklığını düşürmek ayarlayabilir ve elle yönlendirmesi için sıcaklık göstergesi bekleyin. </li><li> 10-20 dakika zaman aralıklarında 8-10 saat kurtarma aşamasında kayıt time-lapse film. Doğru ilk kez noktasının yakalanması sırasında odaklama için kontrol edin. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü Analizi NOT: sitozolik odak taşıyan hücrelerin sayısını ölçmek hücrelerin toplam sayısını ve her bir zaman sitosolik odağı olan hücre sayısını değerlendirmek içinçerçeve. Nedeniyle parlak bir alan görüntülerden hücrelerin segmentlere zorluğu, ölçümü elle yapılması gerekir. Aşağıda, veri analizi ücretsiz görüntü işleme paketi ((http://fiji.sc/Fiji). Bu &quot;Hücre Sayım Cihazı&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter) eklentisi gerektirir tarif edilmiştir. <ol><li> Hücrelerin sayısını değerlendirmek <ol><li> &quot;Dosya&quot; ve &quot;Aç&quot; linkine tıklayarak parlak alan görüntü yığınını (XYT) yükleyin. </li><li> &quot;Sayaç Cell&quot; eklentisi (- &quot;Hücre Sayım Cihazı&quot; &quot;Eklentiler&quot;) açın. &quot;Initialize&quot; tıklayarak Görüntü yığını yükleyin. </li><li> uygun kutuyu işaretleyerek sayaçları uygun türü seçin. NOT: Toplam hücre sayısı ve sitozolik odaklarla hücreleri için sayaç olarak tip 2 sayıcı olarak kullanılması tip 1. Tüm hücreleri saymak. </li><li> &quot;Kaydet İşaretleyiciler&quot; tıklayarak belirteçler kaydedin. </li></ol></li><li> Sitozolik odaklarla hücrelerin sayısını değerlendirilmesi <ol> &lt;li&gt; floresan görüntü hyperstack (XZYT) ( &quot;Dosya&quot; - &quot;Aç&quot;) yükleyin ve &quot;Z-Projektör&quot; (Resim / Yığınları) kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyon yapmak. </li><li> &quot;Sayaç Cell&quot; eklentisi açın. &quot;Initialize&quot; tıklayarak çıkan görüntü yığınını (XYT) yükleyin. </li><li> &quot;Yük İşaretleyiciler&quot; tıklayarak belirteçler yükleyin. DİKKAT: Referans görüntü ve floresan yığınının dosya adları aynı olmalıdır. Gerekirse, görüntü yığını başlatılırken önce buna göre yeniden adlandırın. </li><li> Uygun işaret türünü seçin (3.1.3) ve sitozolik odaklarla hücreleri saymak. Mevcut belirteçler tek tek hücrelerin konumu için bir yol gösterici olarak kullanılabilir. </li><li> &quot;Sonuçlar&quot; butonuna tıklayarak dilim başına sayıyı almak ve sonraki hesaplamalar için başka bir yerde sayar kaydedin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+a+model+organism:+progress+with+Dictyostelium.">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li><li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+finds+new+roles+to+model.">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li><li>M&#252;ller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+system+-+substantial+share:+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine.">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li><li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q/N-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation.">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li><li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+in+Dictyostelium:+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem.">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li><li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms.">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li><li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium.">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li><li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+yeast.">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li><li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+response+of+Dictyostelium.">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada açıklanan protokol ısı stresine yanıt olarak, ilgilenilen özel bir proteinin davranışını incelemek üzere kullanılabilir. 30 ° C sıcaklık artışı sıcaklık stresi yanıt tetiklemek için bildirilen ve D, bu koşullar altında yaşayabilirliği edilmiştir diskodeyum belirgin azalır. Değişiklikler Protokol, aynı stres koşulları altında farklı proteinler davranışını görmek için değiştirilebilir. Bu, aynı flüoresan etiketle farklı proteinler ifade eden hücreler, örneğin dört odacık tabaklar (bölüm 1.3.1) halinde, çok oyuklu tabaklara aktarılır. protokol, örneğin GFP veya RFP gibi farklı belirteçler, proteinler ko-eksprese eden hücreler üzerinde de uygulanabilir. Bu protein kalite kontrolü (PQC) sisteminin farklı bileşenleri davranışını izlemek için kullanılan, örneğin olabilir. GFP etiketli agregasyon Marker farklı TTT-etiketli PCQ bileşenleri ifade eden hücreler çok çukurlu kullanılarak gözlenebilirgörüntüleme için bombeli. Bu, aynı stres koşulları (sıcaklık artışı / azalması, sıcaklık artış / azalış süresi hız) sağlar ve karşılaştırmalı çalışmalar için izin verir. Ayrıca protokol sıcaklık stresi yanıtına PQC sisteminin etkisini incelemek için kullanılabilir. Bileşenlerin etkinlik, knock-out veya aşırı ekspresyonu genetik araçlar kullanılarak ifade seviyeleri değiştirerek veya ticari olarak temin edilebilen özel inhibitörleri 6 ile modüle edilebilir. proteazom büyüme ortamına MG132 (100 uM) ya da Laktasistin (10 uM) ilave edilerek engellenebilmektedir. şaperon Hsp90 geldanamisin (6 uM) ya da radicicol (10 uM) kullanılarak inhibe edilebilir. Şimdiye kadar bizim deneysel ortamlarda inhibisyon etkinliğini teyit edemeyeceğini, ancak hastabakıcı Hsp70, VER-155088 ile inhibe edilebilir. İnhibitörler görüntüleme bir gün önce eklenmelidir ve hücreler 14 saat daha inkübe edilir. great.Thanks<html> Protokol çerçevesinde cal Adımlar Isı kaynaklı pertürbasyonun değerlendirilmesi için kritik adım görüntüleme deney öncesinde hücrelerin durumudur. Mayada çalışmalar Hücreler durağan aşamaya 13 boyunca çevresel strese çeşitli direnci elde gösterdi. Biz de D. ise uygulanan ısı stresi minimum tepki gözlendi diskodeyum hücreleri önce görüntüleme sabit faz ulaşmıştı. Bu nedenle, sabit bir hücre sayısı elde &lt;5 x 10 5 hücre / ml kritiktir. Ayrıca, yüksek hücre sayısı D vejetatif döngüsü geçiş indükleyebilir böylece sıcak stresine farklı bir tepki yol açabilecek açlık yolları, tetikleme, gelişimsel döngüsüne diskodeyum. Yüksek hücre sayıları ısı stresi, akarsu sonrası iyileşme aşamasında ulaşılır ve hücreler odak dışında hareket olarak toplayarak hücreler veri analizi ile müdahale durumunda (bakınız Şekil 4). içerik &quot;&gt; Tekniği Sınırlaması odak kaybı protokolünün darboğaz olduğunu. sıcaklık değişimleri sırasında, odak düzlemi hemen sıcaklık değiştirdikten sonra bir süre içinde manuel odaklanma gerektirir, büyük ölçüde kayabilir. odak atlamak bazen zaman noktaları arasındaki zaman yüksek, özellikle yazılım otofokus tarafından üstesinden gelinmesi gereken çok aşırı olabilir. kullanılan mikroskop bir donanım otofokus ile donatılmış Ancak, bu darboğaz atlatılabilir. Mevcut Yöntemlerine Göre Tekniği Önemi Böyle klimalı odalarda, amaçlarını ve mikroskop sahne veya sıcaklık kontrollü aşamaları ve objektif yaka kapsayan sıcaklık kontrollü kuluçka kutuları kullanımı gibi mevcut kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir soğutma odası kullanımı ortam daha hassas kontrol sağlar sıcaklık. soğutma bölmesi içinde Peltier parçası sabit ve muntazam bir TEM korumakdeney düzeneği boyunca lığı. Klasik kurulumları, yerel sıcaklık farklılıkları, değişik gözlem sonuçlarına yol açabilir. Klasik kurulumları özellikle sıcaklığının düşürülmesi, uyarılmış sıcaklık değişikliklerine çok yavaş adapte ederken Dahası, sıcaklık kaynaklı değişikliklere çabuk ve hızlı cevap verebilir. soğutma bölmesi içinde Peltier parçası, aynı zamanda, 15 ° C ya da 40 ° C olarak ulaşan sıcaklıklarda çok zor olan klasik kurulumları daha geniş bir sıcaklık aralığı (15-40 ° C) kapsayabilir. Dictyostelium discoideum verilmedi-toksisiteye özellikle duyarlıdır. Önceki çalışmalar foto-toksisitesini azaltmak için süpürücü olarak askorbat kullanılır. Ancak, uzun görüntüleme süreleri ek takviyesi gerektirir. Ayrıca, askorbat kullanımı ilgi mekanizması antioksidan takviyesi etkilenmez çalışmalar sınırlıdır. O sıcaklık kontrollü bir görüntüleme alternatif yakl olarak kullanılabilir teklifoach verilmedi-toksisiteyi en aza indirmek için ve daha fazla toksisite azaltmak için askorbat eklenmesiyle birleştirilebilir. Fototoksik etkilerini bir soğutma odası kullanılarak 23 ° C&#39;lik bir sabit ve muntazam bir ısı sağlanarak en aza indirilebilir. Sıcaklık kontrolü kullanarak görüntülü hücreler daha uzun bir süre için foto-toksisite, hücre yuvarlama az belirtileri göstermektedir. Bu aynı zamanda yüksek şiddetlerde küçük zaman aralıkları veya görünümü (FOVs) daha fazla alanları ile görüntüleme sağlar. Genel Başvuru Daha yüksek sıcaklıklarda ısı stres farklı ısı stres yanıtı 14 tetiklemek için gösterilmiştir. Bu nedenle, 34 ° C ya da 37 ° C sıcaklığının artırılması başka bir yanıtı ortaya çıkarabilir. uygulanan sıcaklık stresine ilaveten, belli bir yük durumu süresi sıcak stresine hemen yanıt ya da uzun süreli uyum incelemek için modifiye edilebilir. Genel olarak, açıklanan protokol olabilirgeniş bir uygulama seti genişletilmiş. Hassas sıcaklık kontrolü önemli verilmedi toksik etkilerini azalttığı için, iletişim kuralı, ya da kısa aralıklarla ile bir arada, düşük ekspresyon düzeyi ile protein görselleştirmek için, örneğin, yüksek etki süreleri ve / veya daha yüksek uyarım ışık şiddetleri, gerektiren işlerde kullanılır time-lapse görüntüleme sırasında görüntüleme, örneğin, arasındadır. Aynı zamanda tam hücre kapsayan nesneleri görüntüleme için avantajlı olabilir, örneğin, mikrotübül, bu ayarlar optik z bölümlerin yüksek sayıda gerektiren.

Diktiyostelyum diskodeyum fagositozu tarafından alınır bakteri ve diğer mikroorganizmaların, beslenen yalnız toprak yaşayan amipler vardır. Onun keşfinden 1 yılından bu yana araştırma önemli bir alan olmuştur eşsiz ve olağanüstü yaşam döngüsü vardır. Çok hücreli gelişim 2 ve kemotaksis 3 moleküler temeli erken faiz yakında hücre hareketi, hücre polarite, doğuştan bağışıklık odaklanarak çalışmalarla tamamlanmaktadır. Buna ek olarak, D. diskodeyum biyomedikal araştırma 4,5&#39;ten için bir model sistem olarak tanıtıldı. Son zamanlarda, biz D. kurdu diskodeyum protein kalitesi kontrolü (PQC) sistem 6,7 incelemek için yeni bir sistem olarak. Onun proteom protein kalite kontrolü 8 bir sorun teşkil etmektedir toplama eğilimli prion-benzeri proteinler, zenginleşmektedir. D. olup olmadığını araştırmak diskodeyum onun son derece ag kontrol etmek için özel moleküler mekanizmaları geliştirmiştirgregation eğilimli proteom, normal gelişim koşulları altında ve stres esnasında her iki çekiş eğilimli markör proteinlerin davranışı incelenmiştir. Bu tür ısı stres gibi stres koşulları, protein 9 yanlış katlayan oranını artırmak için kullanılabilir. Bu nedenle, biz sıcaklık değişikliklere neden ve aynı zamanda işaretleyici proteinlerin davranışını takip edebilecek bir sistem arıyordu. Bu amaçla, bir ısıl aşama uç (soğutma odası) kullanılarak Peltier kontrol ısıtılarak canlı hücre görüntüleme birleştirildi. Bu yöntem sürekli ve üniform bir sıcaklığı korumak hem de hızlı bir şekilde, ama kesin bir sıcaklık değişimine neden izin verdi. Canlı hücre görüntüleme D. biyolojik süreçlerin çeşitli incelemek için kullanılır diskodeyum. Ancak, bu yaklaşım iki önemli sınırlamalar ile karşı karşıyadır. İlk olarak, hücreler böylece bireysel hücrelerin izleme, yüksek hareket kabiliyeti göstermek ve görüş alanının dışına göç eğilimi genellikle geniş bir alanın görüntüleme gerektirir. Hücre hareketlilik olabilirAgar bindirme 10 azaltılabilir, ancak bu koşullar nedeniyle canlılığı bir azalmaya ve uzun vadeli görüntüleme için uygun değildir. İkinci olarak, D. discoideum hücreler, hücre yuvarlama ve mitotik durması 11 sonuçlanan verilmedi-toksisite için özellikle yüksek bir duyarlılık göstermektedir. Önceki protokoller bir kök sürükleyici ve maruz kalma süreleri 12 azaltılması gibi askorbat ilave edilerek bu sorunu ele aldı. İlgili protein düşük seviyelerde sentezlendiği ve zayıf bir floresan sinyalini göstermektedir olan ikinci kritik öneme sahip olabilir. Yazarlar ayrıca, klimalı odada görüntüleme ya da nesnel ve mikroskop sahne 12 kapak sıcaklık kontrollü kuluçka kutuları kullanarak ya 21 ° C sabit sıcaklık sağlamak öneririz. Burada, 23 ° C&#39;de bir soğutma odası kullanılarak, geliştirilmiş sıcaklık kontrollü bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim set-up görüntüleme sırasında önemli ölçüde foto-toksisite direncini artırır. Oyüksek pozlama süreleri ve daha yüksek uyarma ışık şiddetlerinin kullanımını sağlar. zaman aralıkları görüntülü pozisyonların sayısı ve kullanılan poz zamana karşı dikkatle dengelenmiş olması gerekir gibi bu, time-lapse görüntüleme sırasında özel bir önem taşımaktadır. görüntülü pozisyonların sayısının artırılması olanağı da daha geniş bir görüntüleme alanının kapsamı izin verir ve daha uzun bir süre boyunca tek tek hücrelerin izleme kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Açıklanan görüntüleme protokolü amip D. toplama eğilimli prion-benzeri proteinler davranışını analiz etmek için kullanılabilir Isı stresi esnasında discoideum. Şekil 1 30 ° C (Şekil 1B) ve stres iyileşme 6 saat sonra ve en ısı stresinin 2 saat sonra, normal büyüme koşullarında (Şekil 1A) altındaki hücrelerde GFP etiketli poliglutamin proteini Q103 dağılımını göstermektedir normal büyüme koşullarında (Şekil 1C) büyüme. 30 ° C, 23 ° C sıcaklık artışı üzerine, Q103-GFP işaretleyici yapıları noktalı bir yaygın dağıtım birleşir. normal sıcaklıkta stres sürüm ve büyüme üzerine, bu yapıların çözülür. Q103-GFP yeniden dağıtılması ve ısı stres kaynaklı sitosolik odak oluşumu görüntü analizi kullanılarak ölçülebilir. Şekil 2A, Fiji ve eklenti &quot;C kullanılarak tek tek FOVs analizini göstermektedirell sayacı &quot;. Şekil 2B ısı stres yanıtı niceliğini gösterir. Bu sürekli ısı stresi ile sayısındaki sitozolik Q103-GFP odakları artış. ısı stresi sırasında, protein kalitesi kontrolü (PQC) sistem böylece birikmesini, bunalmış olduğunu gösterir prion-benzeri protein, Q103 kadar yatkın proteinler sitosolik odaklarda artan toplam çözünebilir bir halde muhafaza edilemez ve. hücreler de karakteristik bir yuvarlama göstermektedir, Şekil 1B &#39;de gösterildiği üzere. stres çıkarılmasından sonra, sitosolik odaklar azaltılması toplu düşündürmektedir proteinler çözülmüştür. Görüntü kalitesi başlangıçtaki hücre yoğunluğuna kadar hassastır. Şekil 3, uygun başlangıç hücre yoğunluğu (Şekil 3A) ve yüksek başlangıç hücre yoğunluğu (Şekil 3B) karşılaştırılması, stres iyileşme sonrası hücrelerin bir örneği göstermektedir. Başlangıçta hücre yoğunluğu, çok yüksek ise, hücreler yıldızŞekil 3b&#39;de de görüldüğü gibi ted akışları oluşturmak üzere. hücreleri gibi sonraki ölçümü ile ilgili zorluklar getirmektedir hangi Bu odak düzlemi dışına taşındı. tarif edilen yöntem, yukarıda tarif edildiği gibi sıcaklığa bağlı sıcaklık değişiklikleri izlemek için de kullanılabilir. Ayrıca, Şekil 4., Fizyolojik büyüme sıcaklığında görüntülerken, belirli verilmedi-toksisitesini azaltmak için kullanılan bir klima odasında sıcaklık kontrolü olmadan görüntülenmiş bir soğutma odası (Şekil 4A) &#39;de 23 ° C&#39; de görüntülenmiştir hücre ve hücre bir karşılaştırmasını göstermektedir, ayarlanabilir 25 ° C&#39;de (Şekil 4B). sıcaklık kontrollü koşullar altında görüntülendi değilken ikaz ışığı sürekli maruziyet üzerine, hücreler yuvarlak. Hücre şeklinde Bu değişiklik stres işaret etmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Şekil 1: <strong&gt; Toplama eğilimli prion-benzeri proteinler ısı stresi sırasında hücresel dağılımı değişir. GFP etiketli poliglutamin zengin huntingtin ekson 1 (Q103) yapısal AX2-214 D&#39;de ifade edilir diskodeyum hücreleri (ters gri skala arama tablosunda tasvir GFP sinyali). 23 ° C, Q103-GFP normal büyüme şartları altında, (A), diffüz sitoplazmada dağıtılır. 30 ° C ısı stresinin 2 saat sonra (B), Q103-GFP sitosolik odaklar (kırmızı oklar) içine birleşir. Hücreler karakteristik şekil değişikliği gösterir ve yuvarlak. 23 ° C&#39;de gerilme serbest bırakılması ve büyümesi üzerine (C), sitozolik odakları eritilir. 6 saat sonra, herhangi bir sitosolik odakları gözlenebilir. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2: ısı kaynaklı sitozolik odakları oluşumu Niceleme ücretsiz görüntü işleme paketi Fiji ve eklenti &quot;Hücre Sayıcı&quot; kullanarak hücrelerin (A) analizi.. hücrelerin toplam miktarı (tip 1, mavi sayaç işaretleri) parlak bir alan görüntüde belirlenir. belirteçler GFP-kanal ve belirlenir sitosolik odağı olan hücrelerin (tip 2 kırmızı karşı işaretleri) sayısı yüklenir. (B) odaklarının Niceleme 30 ° C&#39;de ısı stresinin 3 saat ve 23 ° C&#39;de stres toparlanma 3 saat sonra. (N = görüntüsü, hata bar = SD 4 alanlar) <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için rakam.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Şekil 3: Uzun vadeli time-lapse görüntüleme hücre yoğunluğunun etkisi ilk hücre yoğunlukları &lt;10 5 hücre / ml görüntülü (A) Hücreler.. 30 ° C ısı stresi, 3 saat ve 23 ° C&#39;de gerilme iyileşme 6 saat sonra, hücreler de bitkisel döngüsü ve bölme kalır. Sadece birkaç hücre odak düzlemi çıkın. (B) hücreler ilk hücre yoğunlukları&gt; 10 6 hücre / ml&#39;de görüntülenmiştir. görüntüleme (A gibi ayarlar) 9 saat sonra hücreler gelişimsel döngüsü girmiş ve akarsu ve bir araya başlamıştır. agrega Hücreler açıkça ayırt edilemez. hücrelerin büyük bir kısmı odak düzlemi çıkar ve analiz edilemez. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Şekil 4:. Fototoksik etkilerini sıcaklık kontrolü etkisi (A) Hücreler, 23 ° C&#39;de sıcaklık kontrollü, 10 dakika boyunca görüntülenmiş (0.5 uM, örnek kalınlığı 8 mikron aralığı) görünümü, z-yığın, zaman atlamalı 6 alanı (toplam süresi 10 dk, lapse 1 dk), GFP kanal (0.07 msn maruz kalma süresi,% 10 lazer yoğunluğu), RFP kanal (0.1 msn maruz kalma süresi,% 10 lazer yoğunluğu). Hücreler fototoksik stres ile ilişkili karakteristik morfolojik değişiklikler hiçbir belirti gösterir. (B) hücreler, (A ile aynı koşullar) sıcaklık kontrolü olmadan, 10 dakika boyunca görüntüsü alınmıştır. Hücreler stres belirten fototoksik kaynaklı yuvarlama belirtileri gösterirler. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Hücreler 100x / 1.4 Sayısal açıklık (NA) amacı ile bir mikroskop dayalı bir sistemde görüntülendi. görüntüler 1 x 1 binning kullanarak 1024 x 1024 piksel dosyaları gibi bir CCD kamera ile toplanmıştır.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging at JoVE.com

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.3K Görüntüleme.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Video: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Biyokimya

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Nörobilim

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Biyoloji

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu ile Hızlandırılmış Canlı Hücre Görüntüleme için Esnek Bir Oda

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Biyomühendislik

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Uzun süreli Canlı Görüntüleme