Name: snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays at JoVE.com

Biz Dr Rob Sladek mürekkep püskürtmeli gözcü kullanım için teşekkür ederim. Sağlık Araştırma (CIHR), Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC), Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü ve Kanada Vakfı için son destek için yenilik (CFI) Kanadalı Enstitüleri üzerinden anıyoruz. DJ teşekkürler bir Kanada araştırma sandalyeden destekler.

1. imalat ve depolanmasını snap cips <ol><li>tek transfer yöntemi ( Şekil 1a) <ol><li>400 µg/mL antikorlar içeren Spot taksi çözümleri ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi % 20 gliserol (PBS) bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) üzerine tahlil slayt ile bağıl nem oranı % 60, bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü 13 (1.2 nL her nokta için) 800 µm Merkezden merkeze boşluğu ile. Slaydı bir köşe göre gözcü güvertede sabit olduğundan emin olun (burada, sol alt köşedeki kullanılmıştır).</li>
		<li>%60 bağıl nem ile 1 h için oda sıcaklığında benekli tahlil slayt kuluçkaya.</li>
		<li>Bir slayt modülü conta 16 kuyu bölmek için tahlil slayt üzerinde 16 bölmeleri ile kelepçe. 80 µL % 0,1 içeren PBS ekleyerek üç kez sürgüyü durulama ara-20 (PBST) her iyi ve titreyen bir shaker, 5 min her zaman üzerinde 450 rpm'de.</li>
		<li>Her şey ve 450 rpm'de 1 h için sallamak için çözümler engelleme eklemek 80 µL.</li>
		<li>Conta kaldırmak ve tahlil slaydı bir akımı azot ile kuru.</li>
		<li>Bir transfer slayt gözcü güvertede düzeltmek ve slayt sol alt köşesinde gözcü güverte karşı sol alt köşesinde itin. Mürekkep püskürtmeli spot hizalama işaretlerini (polistiren mikro-boncuk bir çözüm) oluşan bir dizi ile bu aynı düzeninde kabinler için.</li>
		<li>Kuru hizalama işaretlerini izin. Transfer slayt flip ve belgili tanımlık dip sol köşe karşı sabitleme gözcü güverte üzerine oturtacak.</li>
		<li>20 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve % 1 BSA içeren çözümler lekelenme dAb hazırlayın.</li>
		<li>Gözcü kullanarak &#39; s kamera, resim hizalama işareti bir. Bu resmi bir indirgeme olarak edindiği programa uygulamak ve görüntü tanıma sisteminin en üst sol işareti tanımlamak için mürekkep püskürtmeli gözcü olsun. Onun koordinat dAb dizi ilk spot kullanın. Nokta 8 nL damlacık ile 800 µm Merkezden merkeze aralığını başına.</li>
	</ol></li> <li>Çift Kişilik aktarma yöntemi ( Şekil 1b) <ol><li>sol alt köşedeki karşı mürekkep püskürtmeli gözcü güvertede bir transfer Slayt 1 yerleştirin. Spot 400 µg/mL antikorlar, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA ile bir mürekkep püskürtmeli Mikroarray gözcü bağıl nem oranı % 60, slayda içeren kabinler Çözümleri (0,4 nL her nokta için ve ~ çapı 200 µm). Merkezden merkeze boşluk 400 µm olabilir.</li>
		<li>Taksi damlacıkları tahlil slayt üzerine aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak transfer slayt ile kaplı bir nitroselüloz (ya da functionalized bir cam) tahlil slayt çekin.
		<ol><li>Dönüş tüm altı düğmeleri tarafında ek aparat çekin ve tüm itici açık konumda kilitlemek için 90 derece. Transfer Slayt Slayt tutucu, kabın içinde kırpılmış köşesi sabit pogo PIN bakacak ekleyin. Üç düğme itici altın pogo iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için ilk kümesi açmak.</li>
			<li>Ek aparat ters 4 pogo çivi üzerine oturan nitroselüloz kaplı bir slayt ekleyin. İtici gümüş iğne ile serbest bırakmak ve slaytları hizalama pimleri karşı itti emin olmak için üç düğme ikinci kümesi açmak.</li>
			<li>Ek aparat hizalama sütunlar ve delik bir hassas konumlandırma için kullanarak slayt kutusunda üst kabuk koyarak kapatın.</li>
			<li>Kapalı ek aparat onun kafes yerleştirin ve kapatma sekmesinde tamamen microarrays uygun basınç uygularken yüz yüze getirmek için aşağı doğru itin. 1 dk. için kapalı tutmak</li>
		</ol></li> <li>Slaytları ayırın. Bağıl nem oranı % 60 ile 1 h için oda sıcaklığında tahlil slayt kuluçkaya. Yıkama, engellemek ve tahlil slayt adımlarda 1.1.3 - 1.1.5 açıklandığı gibi kuru.</li>
		<li>Başka bir transfer slayt mürekkep püskürtmeli gözcü güverte ve sol alt köşedeki karşı itme üzerine koyun. 50 ya da 100 µg/mL (bkz. Tablo 1) antikorları, % 20 gliserol ve PBS % 1 BSA içeren spot dAb çözümleri. Her spot 0,8 olduğundan emin nL ve noktalar arasındaki Merkezden merkeze boşluğu olduğunu 400 µm.</li>
		<li>Tahlil ve transfer slayt saklayın. Mühür nem içeren hava geçirmez bir torbada tahlil ve transfer slaytlar ve -20 ° C dondurucuya koydu.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexed ek fiş ile uzun <ol><li>Al dondurucu tahlil slayttan. Çantayı slayt oda sıcaklığına gelene için 30 dk kapalı bırakın.</li>
	<li>Hazırla 7 uçlu seri seyreltilmiş örnek çözümler proteinlerin % 0.05 içeren PBS spiking tarafından ara-20. 
	Not: Burada, bir 5-fold seyreltme faktörü kullanılır. Başlangıç konsantrasyonları her protein için tablo 1'de listelenen.</li>
	<li>Uygun olarak Prepare örnek çözümler. Örneğin, 4 kez içinde PBST tampon insan serumu sulandırmak.</li>
	<li>16-bölme conta tahlil slayt üzerinde kelepçe.</li>
	<li>Pipetting tarafından bir sütunun 8 wells 7 protein seyreltme çözümleri ve protein-Alerjik PBST arabellek çözüm ile doldurun. Aynı slaytta yer alan diğer 8 Wells örnek çözümler pipette. 
	Not: 80 µL çözümler her birinde uygun olabilir iyi. Daha fazla slayt ek örnekler gerektiğinde ölçmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Örnekleri bir shaker gecede üç kez ile shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman üzerinde PBST 4 ° c yıkama slayt veya oda sıcaklığında 1 h için 450 devirde üzerinde kuluçkaya. Conta kaldırmak ve azot gazı akışı altında slayt kuru.</li>
	<li>Parmak izleri ile transfer slayt dondurucudan almak. Çantayı, oda sıcaklığında 30 dakika kapalı tutun. Ardından, % 60 nem sabitleme boncuk rehidrasyon için 20 dk için içeren slayt kapalı Odası (örneğin boş ipuçları kutu) içinde kuluçkaya.</li>
	<li>Transfer slayt dAb damlacıkları aktarmak için bir ek aparatı ( Şekil 2) kullanarak tahlil slayt ile snap. 1.2.2 ek aparat çalışması için bkz.</li>
	<li>Slaytları ayırın. Tahlil slayt % 60 nem sabitleme boncuk 1 h. kelepçe bir 16 yuvası conta ile tahlil slayt içeren bir kapalı odasında kuluçkaya ve 4 kez sürgüyü durulama PBST bir shaker 450 rpm'de 5 dk her zaman kullanma.</li>
	<li>Pipet 80 µL PBS içinde her kuyuya 2,5 µg/mL streptavidin fluorophore içeren çözümler. Bir shaker 450 devirde üzerinde 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>450 devirde shaker üzerinde slayt 3 kez ile PBST ve bir kez distile su ile durulayın. Conta kaldırmak ve azot gazı kullanarak slayt kuru.</li>
</ol> 3. Slayt tarama ve veri analizi <ol><li>635 nm lazer kullanarak Floresans Mikroarray tarayıcıyla tahlil slayt tarama.</li>
	<li>Bir analiz yazılımı (örneğin dizi-pro Çözümleyicisi) 16 kullanarak her nokta net yoğunluğunu ayıklamak.</li>
	<li>Bir istatistik yazılım kullanarak her protein algılama (lod olarak) sınırını hesaplamak ve protein konsantrasyonları örneklerde belirlemek. 
	Not: Y-kesişim noktası standart cu LOD tanımlanırüç kez standart sapmasını tarafından üç bağımsız deneyleri için artan lezzetli.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li><li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers:+CEA,+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases.">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li><li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA.">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li><li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility.">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li><li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-analyte+immunoassay.">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li><li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes.">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li><li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera:+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers.">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li><li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis.">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li><li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays:+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing.">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li><li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-chip+protein+arrays:+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity.">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA:+A+Programmable+Force+Sensor.">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li><li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Colocalization+Microarray:+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples.">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li><li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays.">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li><li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer.">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688 (2015).</li><li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray.">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li><li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance.">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry.">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays.">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li><li>Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+(MetaChip)+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses.">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li><li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis.">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li><li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis.">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28 (2016).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray.">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening.">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li></ol>

McGill Üniversitesi bir patent başvurusu bu iş Huiyan Li ve David Juncker ile bazı yönleri üzerinde mucitler şikayetçi oldu.

Bu çalışmada, araştırmacılar ile temel deneysel kurulum için çapraz-reactivity ücretsiz multiplex uzun yaygın olarak kullanılabilir duruma getirir bir ek çip teknolojisi sunulmuştur. Varolan antikor microarrays farklı, hiçbir Mikroarray gözcü son kullanıcılar için gereklidir. Hem tek hem de çift transfer yöntemleri gösterdi ve Çift Kişilik transfer affords üstün hizalama doğruluğu aşağı ~ % 98'i lekeli 63 µm14en büyük kayma için 40 mikron. Bir roman ek aparatı elverişli bir konuma sahip bu teknoloji araştırmacılar erişilebilir hale getirme tutarlı basınç ile iki slayt ek bileşeni için geliştirilmiştir. Güvenilir reaktif transfer nitroselüloz kaplı slaytlar değil sadece, aynı zamanda normal cam slaytlara, önemli ölçüde bu teknoloji yoğun eğitim, gerek kalmadan genişleyen gerçekleştirilmektedir. Ek fiş kullanımını göstermek için bir 50-plex immunoassay önceden benekli ve saklı slaytlar kullanılarak yapılmıştır ve proteinlerin % 70 LODs aralığı pg/mL14' te elde. Parmak izleri bir karışımı uygulamak varolan multiplex uzun, ACM ve ek çip teknolojisi önemli bir yararı böylece eklemek veya olmadan herhangi bir antikor çiftleri kaldırmak için izin bir yonga üzerinde deneyleri, bağımsız karşılaştırılır diğer bir çift ile müdahale. Onlarca yüzlerce proteinlerin aynı anda böylece her antikor 17seri uygulama gerektiren sıralı kuluçka tarafından otomatik seri ölçüm gibi diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında tahlil zaman kısaltma bir ek çip ile ölçülebilir. Yalnızca alt-nanoliter her antikor, daha geleneksel uzun daha ekonomik hale ek çip imalat için gereklidir.
Kullanılan antikor konsantrasyonları ve antijen kuluçka adımları yüksek tahlil hassasiyet elde etmek için önemlidir. Ek fiş fabrikasyon antikor konsantrasyon antikor çiftleri ve tahlil slaytları (nitroselüloz veya nitroselüloz olmayan) türleri benzeşme bağlı olarak getirilebilir. Her antikor spot hacimleri gözcü kapasite ve hizalama doğruluğu göre ayarlanabilir ve noktalar arasındaki Merkezden merkeze boşluğu buna göre değiştirilebilir. 1 h. gecede kuluçka 4 ° C'de daha iyi antikor Bağlama kapasitesi verebilir için kabinler için tahlil slayt aktardıktan sonra biz tahlil slayt oda sıcaklığında inkübe. BSA serbest dengeleyici Çözümleri (malzemelerin tabloya bakın) burada taksi kuluçka sonra tahlil slayt engellemek için kullanılmıştır. Hayvan serum veya süt gibi diğer engelleme reaktifler de bu uygulama için işe yarayabilir.
Çoğaltılmış uzun içinde iletişim kuralları ile farklı yüzey kimyası nitroselüloz olmayan slaytlar için geliştirilen ve en iyi duruma getirilmiş. Farklı seyreltme faktörü hedef proteinler bağlı olarak standart eğrileri yapmak için kullanılabilir. Farklı fluorophores parmak izleri etiketlemek için kullanılan ve bir lazer farklı bir dalga boyu sinyal koleksiyonu için kullanarak slayt taranabilir.
Şu anda, bir yoğunluk 625 noktalar/cm2 Çift Kişilik transfer yöntemi14ile elde edilmiştir. Daha fazla ek çip çoğullama kapasitesini geliştirmek için çeşitli stratejiler mevcuttur. İlk olarak, daha küçük birimler böylece daha kısa Merkezden merkeze mesafe artan dizi yoğunluğu arasındaki noktalar için izin noktalar boyutunu azaltmak için kullanılabilir. İkinci olarak, bir nokta boyutunu azaltmak için daha hidrofobik yüzey ile transfer slayt seçebilirsiniz. Üçüncü olarak, iki microarrays arasında daha iyi uyum mürekkep püskürtmeli gözcü hassas ayar yapmak ve daha fazla gibi püskürtme uçlarını ve slayt yüzey arasındaki mesafe tespit parametreler optimize etmek tarafından elde.
Mevcudiyeti ve kalitesinden de antikorlar tabi tüm antikor tabanlı uzun gelince, ek çip immunoassay performanstır. ELISA en çok kullanılan tahlil biçiminde sayesinde yüksek duyarlılık ve özgüllük farklı epitopları hedefleme antikorlar bir çift çift, sıralı bağlama tarafından tanınan bir sandviç tahlil biçiminde kullanarak ek çip çalışır ama bağımlı olduğu uyumlu antikorlar yakalama ve hedef protein tespiti için gerekli bir çift kullanılabilirliği.
Ek çip teknolojisi değerini uzun için kurulur ve çapraz-contaminations18,19 olmadan farklı reaktifler uygulama gerektiren herhangi bir kimyasal ve biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir bekleniyor , 20 , 21 , 22. aslında, ek chip Mikroarray-için-böylece tahlil işlemde, çip imalat kesilmesi Mikroarray, üzerinden çeşitli önceden benekli reaktifler sunmak için genel bir çözüm sağlar ve bu nedenle yardımcı olur adresleme " Makro mikro"arabirim meydan23. Örneğin, ek fiş 4-plex homojen enzim inhibisyonu tahlil için hassas zamanlama ve büyük hacimli deneyler14karşılaştırılabilir sonuçlar ile 128 koşulları analiz etmek için kullanılmıştır. Ayrıca çoğaltılmış doku boyama için uygulanmıştır. Buna ek olarak, uyuşturucu uygulamaları kimyasallar farklı bakteri veya hücreleri tek hücre analizi21,24, binlerce test etmek için ya da tek veya çok adım kimyasal farklı koşullarda test etmek için eleme için katkıda bulunabilir tepkiler.

Birden fazla protein oluşan biyolojik bir panel daha yüksek duyarlılık ve özgüllük kanserleri1,2gibi karmaşık hastalıkların tanısında tek bir biyomarker daha sağlayabilir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) klinik laboratuvarlar bir limit düşük pg/mL plazma, algılama, ama sınırları tahlil3,4,5başına bir hedefe ulaşmada kullanılan altın standart teknoloji olmuştur. Paralel bir tek mikroskop slayt6,7,8bin-in küçültülmüş deneyleri accomodating yürütülen için antikor microarrays geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemin çoğullama yeteneği parmak izleri, karışımı uygulamadan kaynaklanan reaktif tahrik olan ile sınırlıdır ve hedefleri9,10 giderek artan sayıda daha sorunlu hale gelir , 11. Pla ve ark. Sonuçta ortaya çıkan güvenlik açığı bir multiplex sandviç testin hedefleri12numarası N olan 4N(N-1) ölçekler belirttiler.
Antikor microarrays, antikor colocalization Mikroarray olan etkisini azaltmak için (ACM) bizim laboratuvar multiplex sandviç tahlil12için geliştirilmiştir. Yakalama antikorlar (taksi) bir substrat Mikroarray gözcü ile tespit. Sonra engelleme örnekleri yüzeye uygulanır ve sonunda bireysel dAbs taksi-antijen kompleksi aynı noktalar üzerinde gördü. Antikorlar antijenleri arasındaki tüm olan senaryoları ACM ile azaltılabilir ve algılama pg/mL, sınırlarını elde ettik. Ancak, tahlil Protokolü hazırlama ve bir yerinde Mikroarray gözcü yüksek hassasiyetle pahalı ve zaman alıcı hizalama amaç için kullanarak, bu teknoloji içinde geniş uygulama sınırlama deneyler sırasında parmak izleri tespit gerekir diğer laboratuvarlar. Ek çip adında bir el ACM için çapraz-reactivity ücretsiz geliştirilmiştir ve gözcü-Alerjik multiplex sandviç uzun13,14,15. Kabinler ve parmak izleri bir tahlil slayt ve sırasıyla Mikroarray biçiminde bir transfer slayt üzerine önceden tespit ve depolanır. Tahlil sırasında slaytlar alınır ve dAbs Mikroarray aktarılır topluca tahlil slayt sadece birlikte iki fiş şaklatarak. Bir ek aparatı güvenilir reaktif aktarımı için kullanılır. Nispeten büyük antikor Bağlama kapasitesi ile kaplı nitroselüloz slaytlar sıvı damlacıkları emmek için tahlil slaytlar olarak kullanılmış ve böylece reaktif transfer kolaylaştırıcı, ancak, slaytları normal cam slaytlar ve Mikroarray daha daha pahalıdır saydam olmayan slaytlar ile uyumlu tarayıcılar sinyal alımı için ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada, multiplex sandviç immunoassay ek çip ile gerçekleştirme Protokolü göstermektedir. Bir roman ek aparatı Mikroarray Mikroarray daha rahat ve güvenilir reaktif transferi için geliştirilmiştir. Önemlisi, burada reaktif aktarma yöntemi ek çip ile normal cam slaytlar üzerine kurduk. 1024 noktalar başarıyla transfer ve bu teknolojinin en laboratuarlarında kullanımı önemli ölçüde genişleyen bir cam slayt üzerine hizalanmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline tablet</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-conjugated Cy5</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose coated slides</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilane coated slides</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Inkjet microarray spotter</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Slide module gasket</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Stabilization Beads</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer software</td><td>Media Cybernetics</td><td>Version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microarray scanner</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray Scanner</td><td></td></tr><tr><td>Biostatistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin capture antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin detection antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6&lt;sup&gt;a (see Table 1)&lt;/sup&gt;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6&lt;sup&gt;b (see Table 1)&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays

Çoğaltılmış protein analizi üstün tanılama hassasiyet ve doğruluk için tek proteinler karşılaştırıldığında göstermiştir. Antikor microarrays aynı anda tek bir yonga üzerinde gerçekleştirilen mikro ölçekli uzun binlerce sağlar. Sandviç tahlil biçimi her hedef iki antikorlar ile tespit ederek tahlil özgüllük artırır, ancak böylece çoğullama yeteneklerini sınırlayan reaktifler arasında olan muzdarip. Antikor colocalization Mikroarray (ACM) çoğaltılmış protein çapraz-reactivity ücretsiz algılama için geliştirilmiştir, ancak pahalı bir gözcü yerinde Mikroarray imalat deneyleri sırasında için gerektirir. Bu çalışmada, biz sadece dayama iki fiş birlikte, böylece hiçbir gözcü örnek kuluçka ve algılama antikor (dAbs) sonraki uygulama sırasında gerekli tarafından Mikroarray Mikroarray reaktif aktarır bir ek çip teknolojisi göstermek depolama öncesi benekli slayt, slayt hazırlama tahlil yürütme dissociating. Her iki tek ve Çift Kişilik transfer yöntemleri iki microarrays arasında doğru uyum elde etmek için sunulmaktadır ve slayt imalat yöntemleri açıklanmıştır. Sonuçları gösteriyor ki &#60; 40 mikron hizalama 625 noktalar/cm2bir dizi yoğunluğu ulaşan Çift Kişilik transferi ile elde. 50-plexed immunoassay çoğaltılmış protein analizi ek yongasında kullanılabilirlik göstermek için yapılmıştır. Sınırlar 35 proteinlerin algılama aralığı pg/mL vardır.

Hem tek hem de çift transfer yöntemleri için tahlil yordamı şekil 1' de gösterilen. Tek transfer, kabinler doğrudan tahlil slaytta lekeli ve dAbs kabinler (Şekil 1a) bir ayna model kullanımda üzerine tahlil slayda aktarılır. Tek bir aktarım yordam gereklidir, ancak esas olarak slaytla mürekkep püskürtmeli makas köprüsü (Şekil 2) arasındaki açısal kayma nedeniyle iki microarrays arasında kayma bu yöntem muzdarip. Bu sorunu çözmek için bir yaklaşım olduğunu tespit ve slaytları ek aparat düzgün sabitleme sonra kabinler ve dAbs ardışık olarak tahlil slayda aktarmak (Şekil 1b). Bu yöntemi kullanarak, her iki microarrays tam olarak aynı konuma aktarılır. Hiçbir görüntü tanıma sistemi veya hizalama işaretçisi Çift Kişilik aktarma yöntemi için gereklidir. % 98'i için hatalı hizalaması noktalar 41 µm, tek transfer yöntemi14' e göre 6-fold gelişme içinde yapıldı.
Ek aparatı herhangi bir eğitim almadan kullanımı kolay ve dizi kayma riskini en aza indirmek için tasarlanmıştır. Slaytları hizalama pimleri tahlil ve transfer slaytlara ortak sayesinde doğru konumlandırma ile birlikte götürülür. Transfer slayt ek cihaz kapanana kadar pogo pins tarafından askıya zaman tahlil slayt sığdırmak için biraz daha küçük. Ayırıcı cam kaymak için güvenilir damlacık transferini sağlıyor mikrometre ölçekli bir boşluk korumak transfer slayt bulunur. Son olarak, kafes ve onun kapatma sekmesinde her ek tekrarlanabilir, yüksek kalite aktarmak için etkili aktarımı için gerekli basınç uygulamak için tasarlanmıştır. Ek aparat fotoğrafını şekil 3' te gösterilmiştir.
Temsili resim gösteren reaktif transfer nitroselüloz slaytla bir cam slayt üzerine sonuç şekil 4' te gösterilmiştir. Alexa IgGs etiketli 532 ilk reaktifi kullanılmıştır ve Alexa 647 IgGs etiketli ikinci reaktifi kullanılmıştır. Aktarımdan sonra slayt 532 ile taranmıştır nm ve 635 nm lazerler. Sonuç gösteriyor ki 3136 (için nitroselüloz slayt) veya 1024 (cam slayt için) mikrospots tahlil slayta sıfır hata ile transfer edildi ve Çapraz bulaşma ikinci reaktif aktarma üzerine gözlendi. Cam slaytlar kullanırken, functionalization, böylece her spot sildiyseniz ve noktalar daha çok sayıda aktarmak için nokta nokta mesafe azalan tarafından daha hidrofobik yüzey oluşturmak mümkündür. Bu eser ek çip teknolojisi uygulama için genel olarak kullanılan cam yüzeylerde genişletir.
Standart eğrileri 50-plex immunoassay hedefleme meme kanseri ile ilgili proteinler şekil 5en büyük katlı sandviç antikor Mikroarray olan olmadan tarihe karşılık gelen, gösterilmiştir. Çift-transfer yöntemi bu tahlil kullanıldı, slayt tarandı ve floresan yoğunluğu standart eğriler oluşturmak için sayılabilir. 35 dışarı-in 50 protein ulaştı LODs pg/mL (bkz. Tablo 1) ve tahlil koşulları optimize ederek daha da geliştirilmiş. Reaktifler colocalization olan olmadan tek bir slayda birden çok antikor çiftlerini kullanımını kolaylaştırır ve diğer çiftleri12tarihinde her çift bağımsız olarak herhangi bir girişim ile optimizasyonu sağlar. Bu sonuçlar ek çip, çoğaltılmış protein miktar için kullanılan ölçeklenebilir bir teknolojidir gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig1.jpg"> 
Şekil 1. Tahlil yordam tek (a) ve (b) çift aktarım yöntemlerini karşılaştırma şematik. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig2.jpg"> 
Şekil 2. Tek Kişilik transfer arasındaki farkları gösteren şematik. (a) yansıtma aktarım reaktifler mürekkep püskürtmeli XY sahne ve slayt arasındaki açısal kayma güçlendirir. (b) çift-transfer yöntemi açısal kayma üstesinden gelir. Başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig3.jpg"> 
Şekil 3. Ek aparat fotoğrafı. (a) açılan aygıt. (b) kapalı aygıt. (c) perspektif görünüm cihazın. Kısaca, (i) Aktarım slaytları slayt yuvasına konumlandırılmış ve hizalama pimleri üzerinde itici monte pogopin kullanarak karşı itti. (ii) tahlil slaytlar pogopins üstüne yerleştirilir ve itici, ikinci bir kümesini kullanarak hizalama pimleri karşı itti. (iii) üst kabuk slayt tutucu üst kısmında konumlandırılmış ve kafesin içine eklenmiş. Bir basınç pogopin sıkıştırmak ve slaytları bir araya getirmek için kapatma sekmesini kullanarak uygulanır. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig4.jpg"> 
Şekil 4. Bir ek kozu kullanımı lekelerin toplu transfer. 532 kullanarak Floresans tarama nm ve bir (a) nitroselüloz üzerine antikorlar transferini göstermek için 633 nm lazerler (b) cam slayt ve slayt (başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig5.jpg"> 
Şekil 5. Bir tahlil slayt görüntüsünü Floresans ve 50 proteindir standart eğrileri Çift Kişilik aktarım yöntemini kullanarak paralel olarak ölçülen. (a) standart bir eğri oluşturmak için bir tahlil slayt floresan görüntü. (b) bir dizi close-up. Ölçek çubuğu 2 mm. (c) standart eğrileri 50 proteinler için =. Hata çubukları olarak standart sapmalar üç bağımsız deneyler üzerinden hesaplanır. Başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein adı</td>
			<td>Başlangıç konsantrasyonu (ng/ml)</td>
			<td>LOD (pg/ml)</td>
			<td>Protein adı</td>
			<td>Başlangıç konsantrasyonu (ng/ml)</td>
			<td>LOD (pg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANG2</td>
			<td>500</td>
			<td>1.3 × 104</td>
			<td>Il-6b</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr></tbody></table>	<td>BDNF</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 102</td>
			<td>IL-5</td>
			<td>50</td>
			<td>77</td>
		
		<tr>
			<td>CA 15-3 *</td>
			<td>1</td>
			<td>4,9 × 103</td>
			<td>IL-4</td>
			<td>1000</td>
			<td>1.5 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEA</td>
			<td>1000</td>
			<td>5.4 × 103</td>
			<td>IL-2</td>
			<td>50</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10/IP-10</td>
			<td>50</td>
			<td>1,7 × 102</td>
			<td>LEP</td>
			<td>200</td>
			<td>4.0 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRP</td>
			<td>200</td>
			<td>44</td>
			<td>MIG</td>
			<td>500</td>
			<td>11 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>1000</td>
			<td>6.2 × 102</td>
			<td>CCL3/MIP-1α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50</td>
			<td>1.8 × 102</td>
			<td>CCL4/MIP-1β</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>200</td>
			<td>1.9 × 102</td>
			<td>MMP-3</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAS-L</td>
			<td>500</td>
			<td>4.5 × 102</td>
			<td>M-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>8.2 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 103</td>
			<td>MMP-9</td>
			<td>200</td>
			<td>3.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>39</td>
			<td>CCL2/MCP-1</td>
			<td>50</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>50</td>
			<td>3.8</td>
			<td>NCAM-1</td>
			<td>500</td>
			<td>1,7 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRO-α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.0 × 102</td>
			<td>β-NGF</td>
			<td>200</td>
			<td>1.4 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2</td>
			<td>500</td>
			<td>3,5 × 103</td>
			<td>NT-3</td>
			<td>200</td>
			<td>5.8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>200</td>
			<td>73</td>
			<td>OPN</td>
			<td>500</td>
			<td>1.9 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1β</td>
			<td>500</td>
			<td>7.9 × 102</td>
			<td>RBP4</td>
			<td>200</td>
			<td>1.2 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il-1ra</td>
			<td>200</td>
			<td>1.1 × 103</td>
			<td>SPARC</td>
			<td>1000</td>
			<td>4,6 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>50</td>
			<td>8.2 × 102</td>
			<td>TNF-α</td>
			<td>50</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>TNF-RI</td>
			<td>50</td>
			<td>1.3 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-11</td>
			<td>500</td>
			<td>1.2 × 103</td>
			<td>TNF-RII</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>500</td>
			<td>6.1 × 102</td>
			<td>FAS/TNFRSF6</td>
			<td>200</td>
			<td>2,8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>50</td>
			<td>6,6</td>
			<td>uPA</td>
			<td>200</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-7</td>
			<td>2.5</td>
			<td>26</td>
			<td>uPAR(CD87)</td>
			<td>200</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Il-6bir</td>
			<td>1000</td>
			<td>84</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>200</td>
			<td>6,7 × 102</td>
		</tr>
	

Tablo 1. Protein konsantrasyonları ve 50-plex tahlil arabelleğinden LODs. CA 15-3 için LOD U/ml (*) olduğunu. Başvuru 14 izniyle uyarlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays at JoVE.com

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.5K Görüntüleme.  McGill University and Génome Québec Innovation Centre. Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Video: Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array technology employed combines the advantages of microsphere-based suspension array fabrication with the use of fluorescence microscopy. As described in the video protocol, commercially available 4.5 &#956;m polymer microspheres were encoded into seven different types, differentiated by the concentration of two fluorescent dyes physically trapped inside the microspheres. The encoded microspheres containing surface carboxyl groups were modified with monoclonal capture antibodies through EDC/NHS coupling chemistry. To assemble the protein microarray, the different types of encoded and functionalized microspheres were mixed and randomly deposited in 4.5 &#956;m microwells, which were chemically etched at the proximal end of a fiber-optic bundle. The fiber-optic bundle was used as both a carrier and for imaging the microspheres. Once assembled, the microarray was used to capture proteins in the saliva supernatant collected from the clinic. The detection was based on a sandwich immunoassay using a mixture of biotinylated detection antibodies for different analytes with a streptavidin-conjugated fluorescent probe, R-phycoerythrin. The microarray was imaged by fluorescence microscopy in three different channels, two for microsphere registration and one for the assay signal. The fluorescence micrographs were then decoded and analyzed using a homemade algorithm in MATLAB.

We describe a procedure for profiling salivary proteins using multiplexed microsphere-based antibody arrays. Monoclonal antibodies were covalently linked to fluorescent dye-encoded 4.5 &#x03BC;m polymer microspheres using carbodiimide chemistry. The modified microspheres were deposited in fiber-optic microwells to measure protein levels in saliva using fluorescence sandwich immunoassays.

Polimer Microspheres ve Fiber-optik Paketler kullanma İnsan Tükürük Protein Analiz için çoklu Floresan Microarray

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Kimya

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Saptamak için deneysel protokol<em&gt; Siyanobakteri</em&gt; Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Çevre

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biyokimya

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Biyomühendislik

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Kanser Araştırmaları

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, physiological index and clinical biomarker detection. In this protocol, we provide a detailed description of the steps to develop a rapid, sensitive and quantitative lateral-flow immunoassay (using AuNPs as a marker and mAbs as a probe). The procedure describes the preparation and characterization of colloidal gold, synthesis of the AuNP-mAb conjugate, assembly of the immunochromatographic strip, and methodological investigation of the assay. The results showed that the final strips can be further utilized for the rapid and convenient self-diagnosis of a small molecule, which may provide an alternative tool in the rapid and precise analysis of physiological and biological indices.

Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Biyoloji

Serumda Borrelia-Spesifik IgG ve IgM için Multipleks İmmünoassay

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

Yazar Spotlight: Lyme Borreliosis Teşhisi ve Patojen Araştırmaları için Multipleks İmmünoanalizlerin Kapsamının Genişletilmesi 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Polimer Microspheres ve Fiber-optik Paketler kullanma İnsan Tükürük Protein Analiz için çoklu Floresan Microarray

Saptamak için deneysel protokol

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti