Name: snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays at JoVE.com

Wir danken Dr. Rob Sladek für die Verwendung von Inkjet-Spotter. Wir anerkennen die letzte Unterstützung der kanadischen Institute für Gesundheit Forschung (CIHR), die Naturwissenschaft und Engineering Research Council of Canada (NSERC), die kanadische Krebs Gesellschaft Research Institute und Canada Foundation für Innovation (CFI). D.J. Dank Unterstützung von einem Canada Research Chair.

1. Herstellung und Lagerung von snap Chips <ol><li>einzelne Übertragungsmethode ( Abbildung 1a) <ol><li>Spot Kabine Lösungen enthält 400 µg/mL Antikörper und 20 % Glycerin in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf eine Nitrocellulose (oder einem funktionalisierten Glas) Assay-Folie mit einem Inkjet-Microarray Spotter 13 bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (1.2 nL für jeden Fleck) mit 800 µm-Mitte-zu-Mitte-Abstand. Sicherstellen, dass die Folie auf die Spotter-Deck nach einer Ecke fest (hier links unten verwendet wurde).</li>
		<li>Die gefleckte Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % inkubieren.</li>
		<li>Klemmen eine Folie Modul Dichtung mit 16 Fächern auf der Assay-Folie in 16 Vertiefungen unterteilen. Spülen Sie die Folie dreimal durch Zugabe von 80 µL PBS mit 0,1 % Tween-20 (PBST) in jeweils gut und schütteln bei 450 u/min auf einen Shaker, 5 min jedes Mal.</li>
		<li>Hinzufügen 80 µL blockiert Lösungen für jedes gut und schütteln für 1 h bei 450 u/min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Dichtung und die Assay-Folie mit einem Strom von Stickstoff trocknen.</li>
		<li>Fix eine Transfer-Folie auf dem Spotter-Deck und drücken die unteren linken Ecke der Folie gegen links unten auf dem Spotter-Deck. Inkjet vor Ort eine Reihe von Ausrichtungsmarken (eine Lösung von Polystyrol-Mikro-Kügelchen) mit dem gleichen Layout wie die für die Fahrerhäuser.</li>
		<li>Lassen die Ausrichtungsmarken trocknen. Drehen Sie die Transfer-Folie und setzen Sie ihn wieder auf die Spotter-Deck, Befestigung gegen die untere linke Ecke.</li>
		<li>Bereiten die dAb Schmierblutungen Lösungen mit 20 µg/mL Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % BSA.</li>
		<li>Mit dem Spotter &#39; s Kamera, nehmen Sie ein Bild einer Ausrichtung-Marke. Setzen Sie dieses Bild in das spotting Programm als eine so und bekommen Sie das Bildsystem für die Anerkennung von Inkjet-Spotter, die am obere linken Marke zu identifizieren. Verwenden Sie die Koordinate als den ersten Platz des dAb-Arrays. Platz 8 nL pro Tröpfchen mit einem Abstand von Mitte zu Mitte von 800 µm.</li>
	</ol></li> <li>Double Übertragungsmethode ( Abbildung 1 b) <ol><li>eine Transfer-Folie 1 auf dem Inkjet-Spotter-Deck gegen die untere linke Ecke zu platzieren. Vor Ort Taxis Lösungen mit 400 µg/mL Antikörper, 20 % Glycerin und 1 % BSA mit PBS-Puffer auf der Folie mit einem Inkjet-Microarray-Spotter bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % (0,4 nL für jeden Fleck und ~ 200 µm im Durchmesser). Der Abstand von Mitte zu Mitte beträgt 400 µm.</li>
		<li>Snap der Transfer Folie mit einem Nitrozellulose beschichtet (oder einer funktionalisierten Glas) Assay Folie mit einem Snap-Apparat ( Abbildung 2), die Kabine Tröpfchen auf der Assay-Folie übertragen.
		<ol><li>Wende alle sechs Tasten auf der Seite der Snap-Apparat um 90 Grad zu ziehen und die Kolben in der geöffneten Position verriegeln. Einfügen Sie die Transfer-Folie in den Diahalter in die Buchse mit der abgeschnittenen Ecke mit Blick auf die feste Pogo pin Schalten Sie den ersten Satz von drei Tasten lassen Sie die Kolben mit der goldenen Pogo Pin und sicherstellen, dass die Folien sind gegen die Passstifte geschoben.</li>
			<li>Fügen Sie eine Nitrozellulose-beschichtete Folie in der Snap Apparat Upside-Down-auf die 4 Pogo Pins sitzen. Biegen Sie die zweite Gruppe von drei Tasten loslassen Kolben mit dem Silber-Pin und sicherstellen, dass die Folien sind gegen die Passstifte geschoben.</li>
			<li>Das Snap-Gerät schließen, indem man die Oberschale auf den Diahalter mit der Ausrichtung Säulen und Löcher für eine präzise Positionierung.</li>
			<li>Legen Sie den geschlossenen Snap-Apparat in seinem Käfig und die Registerkarte "Schließung" vollständig nach unten drücken um die Microarrays von Angesicht zu Angesicht beim Anwenden der entsprechenden Drucks zu bringen. Für 1 Minute geschlossen halten,</li>
		</ol></li> <li>Die Folien zu trennen. Die Assay-Folie bei Raumtemperatur 1 h mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % inkubieren. Waschen, blockieren und trocknen die Assay-Folie wie 1.1.3 - 1.1.5 beschrieben.</li>
		<li>Legen Sie einen anderen Transfer Folie auf dem Inkjet-Spotter Deck und drücken gegen die untere linke Ecke. Vor Ort dAb Lösungen mit 50 oder 100 µg/mL von Antikörpern (siehe Tabelle 1), 20 % Glycerin und 1 % BSA mit PBS-Puffer. Sicherzustellen, dass jeder einzelne Strahler 0,8 ist nL und der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Spots beträgt 400 µm.</li>
		<li>Speichern der Assay und der Transfer-Folie. Versiegeln-Assay und Transfer Folien in einem luftdichten Beutel mit Trockenmittel und legte in einem Gefrierschrank-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Gemultiplext Immunoassays mit Snap-Chips <ol><li>Abrufen der Assay-Folie aus dem Gefrierfach. Lassen Sie den Beutel versiegelt für 30 min, bis die Folie auf Raumtemperatur kommt.</li>
	<li>Prepare 7-Punkt seriell verdünnt Beispiellösungen von Spick Proteine in PBS mit 0,05 % Tween-20. 
	Hinweis: Hier wird ein 5-fold Verdünnungsfaktor verwendet. Die ab Konzentrationen für jedes Protein sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
	<li>Vorbereiten Beispiellösungen je nach Bedarf. Z. B. Humanserum 4mal in PBST Puffer verdünnen.</li>
	<li>Eine 16-fach-Dichtung auf der Assay-Folie spannen.</li>
	<li>Füllen Sie eine Spalte von 8 Brunnen mit den 7 Proteinlösungen Verdünnung und eiweißfreie PBST Pufferlösung durch pipettieren. Pipette Beispiellösungen in die weiteren 8 Bohrungen auf derselben Folie. 
	Hinweis: 80 µL Lösungen passen Sie in jedem gut. Weitere Folien können verwendet werden, um bei Bedarf zusätzliche Proben messen.</li>
	<li>Brüten die Proben auf einem Boston-Shaker mit 450 u/min für 1 h bei Raumtemperatur oder für eine Nacht bei 4 ° c waschen der Folie dreimal mit PBST auf den Shaker mit 450 u/min, 5 min jedes Mal. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie die Folie unter dem Strahl des Stickstoffgas.</li>
	<li>Abrufen die Transfer-Folie mit Tupfer aus der Tiefkühltruhe. Halten Sie den Beutel versiegelt für 30 min bei Raumtemperatur. Dann die Folie in einer geschlossenen Kammer (z.B. leere Tipps Box) mit 60 % Luftfeuchtigkeit Stabilisierung Perlen für 20 min für Rehydrierung inkubieren.</li>
	<li>Snap die Transfer-Folie mit der Assay-Folie mit einem Snap-Apparat ( Abbildung 2), die dAb-Tröpfchen übertragen. Siehe Abschnitt 1.2.2 für den Betrieb des Geräts Snap.</li>
	<li>Trennen die Folien. Die Assay-Folie in einer geschlossenen Kammer mit 60 % Luftfeuchtigkeit Stabilisierung Perlen für 1 h. Klemme der Assay-Folie mit einer 16-fach Dichtung brüten und spülen Sie die Folie 4 Mal mit PBST auf einem Boston-Shaker mit 450 u/min, 5 min jedes Mal.</li>
	<li>Pipette 80 µL Lösungen mit 2,5 µg/mL Streptavidin Fluorophor in PBS in jede Vertiefung. 20 min auf einen Shaker bei 450 u/min inkubieren.</li>
	<li>Der Folie 3 Mal mit PBST und einmal mit destilliertem Wasser auf den Shaker mit 450 u/min spülen. Entfernen Sie die Dichtung und trocknen Sie die Folie mit Stickstoffgas.</li>
</ol> 3. Dia scannen und Datenanalyse <ol><li>die Assay-Folie mit einem Fluoreszenz-Microarray-Scanner mit dem 635-nm-Laser scannen.</li>
	<li>Extrahieren die net Intensität von jedem Ort mit einer Analyse-Software (z.B. Array-Pro Analyzer) 16.</li>
	<li>Der Nachweisgrenze (LOD) jedes Proteins mit einer Statistiksoftware zu berechnen und die Proteinkonzentrationen in den Proben zu bestimmen. 
	Hinweis: Die Detailgenauigkeit ist definiert als der Y-Achsenabschnitt der Norm cuRVE erhöht durch drei Mal die Standardabweichung von drei unabhängigen Assays.</li>
</ol>

<ol>
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McGill Universität hat einige Aspekte dieser Arbeit mit Huiyan Li und David Juncker als Erfinder eine Patentanmeldung eingereicht.

In dieser Arbeit haben wir eine Snap-Chip-Technologie vorgestellt, die cross-reactivity-freie Multiplex-Immunoassays für die Forscher mit einfachen Versuchsaufbau weithin verfügbar macht. Anders als bei bestehenden AntikörperMicroarrays, benötigt keine Microarray-Spotter für Endnutzer. Sowohl Einzel-als auch Doppelzimmer Transfermethoden demonstriert, und doppelte Übertragung bietet überlegene Ausrichtung Genauigkeit bis zu ~ 40 μm bei 98 % Flecken, mit die größten Fehlausrichtung von 63 µm14. Eine neuartige Snap-Apparat wurde entwickelt, um bequem rasten die beiden Folien mit gleichbleibenden Druck, dass diese Technologie für Forscher zugänglich. Zuverlässige Reagenz Transfer ist nicht nur auf Nitrozellulose-beschichteten Folien, sondern auch auf regelmäßige Glas-Objektträger, erkannte deutlich erweitern die Anwendung dieser Technologie ohne die Notwendigkeit von Schulungen. Um die Nutzbarkeit des Snap-Chips zu demonstrieren, wurde ein 50-Plex-Immunoassay mit Pre-gefleckte und gespeicherte Dias durchgeführt, und 70 % der Proteine LODs in den Bereich des Pg/mL14erreicht. Im Vergleich zu bestehenden Multiplex-Immunoassays, die Pinselstriche als Mischung gelten, ist ein wichtiger Vorteil der ACM und der Snap-Chip-Technologie, dass die Assays auf einem Chip unabhängig zueinander, wodurch zum Hinzufügen oder Entfernen einer Antikörper-Paare ohne alle anderen Paare stören. Dutzende bis Hunderte von Proteinen können gleichzeitig gemessen werden, mit einem Snap-Chip, dadurch Verkürzung Assay im Vergleich zu anderen Methoden wie die automatisierte serielle Messung durch sequentielle Inkubation die seriellen Anwendung jedes Antikörpers 17erfordert. Für die Snap Chip Herstellung, so dass es wirtschaftlicher als herkömmliche Immunoassays ist nur Sub-Nanoliter jeder Antikörper erforderlich.
Die Antikörper-Konzentrationen verwendet und die Antigen-Inkubation-Schritte sind entscheidend für hohen Assay Empfindlichkeit zu erreichen. Bei der Herstellung der Snap-Chips kann Antikörperkonzentration abhängig von der Affinität der Antikörper-Paare und die Art der Assay-Folien (Nitrozellulose oder nicht-Nitrozellulose) optimiert werden. Die Mengen an jeder Antikörper-Spot lässt sich anhand der Spotter Kapazität und Ausrichtung Genauigkeit und der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Spots kann entsprechend geändert werden. Nach der Übertragung von Kabinen auf der Assay-Folie, inkubiert wir die Assay-Folie bei Raumtemperatur für 1 h über Nacht Inkubation bei 4 ° C besser Antikörper-Bindungskapazität geben könnte. BSA-kostenlose Stabilisator-Lösungen (siehe die Tabelle der Materialien) hier dienten die Assay-Folie nach Inkubation Kabinen blockieren. Andere blockierenden Reagenzien wie tierische Seren oder Milch können auch für diese Anwendung arbeiten.
In Multiplex Immunoassays können Protokolle für nicht-Nitrozellulose Folien mit verschiedenen Oberflächenchemie entwickelt und optimiert werden. Ein anderes Verdünnungsfaktor lässt sich Standardkurven abhängig von der Zielproteine zu machen. Verschiedenen Fluorophore einsetzbar, tupft zu kennzeichnen, und das Dia gescannt werden kann mit Hilfe eines Lasers auf einer anderen Wellenlänge für Signal-Sammlung.
Derzeit hat eine Dichte von 625 Punkte/cm2 mit Doppel-Transfer-Methode14erreicht. Zur weiteren Verbesserung der multiplexing Fähigkeit des Snap-Chips gibt es mehrere Strategien. Erstens können kleinere Mengen verwendet werden, die Größe der Flecken, wodurch kürzere Mitte-Mitte-Abstand zwischen Spots und erhöhte Array Dichte zu reduzieren. Zweitens können eine Transfer-Folie mit mehr hydrophobe Oberfläche, die Punktgröße zu reduzieren. Drittens könnte bessere Abstimmung zwischen den beiden Microarrays durch Feinjustierung der Inkjet-Spotter, und weitere Optimierung der spotting Parameter wie der Abstand zwischen Düsen und die Folie Oberfläche erreicht werden.
Wie für alle Antikörper-basierten Immunoassays ist die Leistung der Snap-Chip-Immunoassay vorbehaltlich der Verfügbarkeit und Qualität von Antikörpern. Die Snap-Chip arbeitet mit einem Sandwich Assay Format, das die am häufigsten verwendeten Assay-Format im ELISA durch die hohe Sensitivität und Spezifität gewährten die dual, sequentielle Bindung eines Paares von Antikörper gezielt verschiedene Epitope ist aber es ist abhängig von die Verfügbarkeit eines Paares von kompatibel zur Erfassung und Erkennung des Zielproteins benötigten Antikörper.
Der Wert des Snap-Chip-Technologie ist für Immunoassays etabliert, und es wird erwartet, dass sie für alle chemischen und biochemischen Reaktionen kann, die erfordern genutzt werden, Anwendung von verschiedenen Reagenzien ohne Kreuz-Kontaminationen18,19 , 20 , 21 , 22. eigentlich die Snap-Chip bietet eine allgemeine Lösung für verschiedene Pre-gefleckte Reagenzien von Microarray, Microarray, so distanzieren die Chip-Herstellung mit dem Assay-Verfahren liefern und daher hilft Adressierung der " Makro-Mikro"Interfacing Herausforderung23. Als ein Beispiel wurde der Snap-Chip für einen 4-Plex-homogene Enzym-Hemmung-Assay zur 128 Bedingungen mit präzisem Timing und vergleichbare Ergebnisse zu großvolumigen Experimente14zu analysieren. Es wurde auch für Multiplex Gewebe Färbung angewendet. Darüber hinaus kann es zur Drogen-screening-Anwendungen, Tausenden von Chemikalien auf verschiedene Bakterien oder Zellen, für die einzelne Zelle Analyse21,24, zu testen oder zu verschiedenen Testbedingungen in ein- oder mehrstufigen chemischen beitragen. Reaktionen.

Eine Jury bestehend aus mehreren Proteinen Biomarker können höhere Sensitivität und Spezifität als einen einzigen Biomarker in der Diagnostik von komplexen Krankheiten wie Krebs1,2. Die Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) wurde der Goldstandard Technik in klinischen Labors erreichen maximal Erkennung bei niedrigen Pg/mL im Plasma, aber Grenzen auf ein Ziel pro Assay3,4,5. AntikörperMicroarrays sind entwickelt worden, denn Platz für Tausende von miniaturisierten Assays parallel auf einem einzigen Mikroskop Folie6,7,8durchgeführt. Jedoch die multiplexing Fähigkeit dieser Methode wird durch Reagenz-driven Kreuzreaktivität, die aus der Anwendung eines Gemisches aus Spitzen, begrenzt und wird es schwieriger mit einer wachsenden Zahl von Zielen9,10 , 11. Pla Et Al. haben erklärt, dass die resultierende Anfälligkeit eines Multiplex-Sandwich-Assays als 4N(N-1) Schuppen wo N ist die Anzahl der Ziele12.
Um Kreuzreaktivität in AntikörperMicroarrays, Antikörper NS1 Microarray zu mildern wurde in unserem Labor für Multiplex-Sandwich Assay12(ACM) entwickelt. Capture-Antikörper (Kabinen) sind auf einem Substrat mit einem Microarray-Spotter gesichtet. Nach Sperre Proben sind auf der Oberfläche aufgetragen, und dann einzelne Pinselstriche werden an den gleichen Stellen mit dem cAb-Antigen-Komplex gesichtet. Alle Szenarien der Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern und Antigenen mit ACM abgeschwächt werden können, und Nachweisgrenzen bei Pg/mL erreicht wurden. Allerdings erfordert der Assay-Protokoll vorbereiten und Schmierblutungen die Pinselstriche während der Experimente mit einer vor-Ort-Microarray-Spotter mit hoher Präzision zwecks Ausrichtung, die teuer und zeitaufwendig ist, begrenzt die breite Anwendung dieser Technologie in anderen Labors. Ein handheld ACM, benannt Snap-Chip wurde entwickelt für cross-reactivity-frei und Spotter-freie multiplex-Sandwich Immunoassays13,14,15. Kabinen und tupft sind bereits gesichtet auf ein Assay und ein Transfer-Folie bzw. im Microarray-Format gespeichert. Während der Test die Folien abgerufen werden und ein Microarray tupft sind gemeinsam auf der Assay-Folie durch einfach fangen die beiden Chips zusammen übertragen. Ein Snap-Apparat ist für zuverlässige Reagenz Übertragung verwendet. Nitrozellulose, beschichtete Folien mit einer relativ hohen Antikörper-Bindungskapazität als der Assay-Folien verwendet wurden, um die Flüssigkeitströpfchen absorbieren und somit Reagenz Transfer erleichtert, die Folien sind jedoch teurer als normales Glas Folien und microarray Scannern kompatibel mit nicht-transparenten Folien sind für die Signalerfassung notwendig.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen das Protokoll für die Durchführung einer Multiplex-Sandwich-Immunoassay mit einem Snap-Chip. Für bequeme und sichere Reagenz Übertragung von Microarray-Microarray wurde eine neuartige Snap-Apparat entwickelt. Wichtig ist, haben wir hier die Übertragungsmethode Reagenz auf regelmäßiges Glas-Objektträger mit dem Snap-Chip etabliert. 1024 Punkte wurden erfolgreich übertragen und auf einen Objektträger, erheblich erweitern den Einsatz dieser Technologie in den meisten Labors ausgerichtet.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline tablet</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-conjugated Cy5</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose coated slides</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilane coated slides</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Inkjet microarray spotter</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Slide module gasket</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Stabilization Beads</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer software</td><td>Media Cybernetics</td><td>Version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microarray scanner</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray Scanner</td><td></td></tr><tr><td>Biostatistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin capture antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin detection antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6&lt;sup&gt;a (see Table 1)&lt;/sup&gt;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6&lt;sup&gt;b (see Table 1)&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays

Multiplex Protein-Analyse ergab höhere diagnostische Sensitivität und Genauigkeit im Vergleich zu einzelnen Proteine. AntikörperMicroarrays erlauben Tausende Mikromaßstab Immunoassays gleichzeitig auf einem einzigen Chip durchgeführt. Sandwich-Assay-Format Spezifität des Assays erkennt jedes Ziel mit zwei Antikörper verbessert, sondern Kreuzreaktivität zwischen Reagenzien, wodurch ihre multiplexing Fähigkeiten leidet. Antikörper NS1 Microarray (ACM) für cross-reactivity-freie gemultiplexten Proteindetektion entwickelt wurde, aber erfordert eine teure vor-Ort-Spotter für Microarray Herstellung während der Tests. In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine Snap-Chip-Technologie, die Reagenz von Microarray-Microarray überträgt, indem einfach schnappen zwei Chips zusammen, somit kein Spotter während der Inkubation der Probe und Nachanmeldung Erkennung Antikörper (Tupfer) auf benötigt wird Lagerung von Pre-gefleckte Folien, Wehre die Folie Vorbereitung von Assay Ausführung. Sowohl Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden werden vorgestellt, um genaue Ausrichtung zwischen den beiden Microarrays zu erreichen und die Herstellung der Folie für beide Methoden werden beschrieben. Ergebnisse zeigen, dass &#60; mit doppelten Transfer erreichen eine Array-Dichte von 625 Punkte/cm240 μm Ausrichtung erreicht wurde. Ein 50-Plexed-Immunoassay wurde durchgeführt, um die Nutzbarkeit des Snap-Chips in Multiplex Protein-Analyse zu demonstrieren. Nachweisgrenzen von 35 Proteine befinden sich in der Reichweite des Pg/mL.

Das Testverfahren für Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden ist in Abbildung 1dargestellt. In einzelnen zu übertragen die Kabinen sind direkt auf der Folie Assay gesichtet und die Farbtupfer auf der Assay-Folie bei Verwendung in einem Spiegel-Muster der Kabinen (Abbildung 1a) übertragen. Nur ein Übertragungsverfahren ist erforderlich, aber diese Methode leidet Fluchtungsfehler zwischen den zwei Microarrays, hauptsächlich bedingt durch die eckigen Versatz zwischen der Folie und der Inkjet-Gantry (Abbildung 2). Ein Ansatz, um dieser Herausforderung zu begegnen ist, Kabinen und tupft nacheinander auf der Assay-Folie nach aufspüren und beheben die Folien in der Snap-Apparat richtig zu übertragen (Abbildung 1 b). Mit dieser Methode werden beide Microarrays in der exakt gleichen Position übertragen. Kein Bild Anerkennung System oder Ausrichtung Marker ist erforderlich für die doppelte Übertragungsmethode. Die Fehlausrichtung für 98 % der Flecken war innerhalb von 41 µm, 6-fold Verbesserung im Vergleich zu den einzelnen Transfer Methode14.
Der Snap-Apparat ist einfach zu bedienen, ohne Schulung und minimieren das Risiko von Array Fehlausrichtung konzipiert. Die Folien sind mit genaue Positionierung Dank Passstifte üblich, Assay und Transfer-Folien zusammengeführt. Die Transfer-Folie ist etwas kleiner, passen unterhalb der Assay-Folie, wenn durch die Pogo Pins, angehalten, bis das Snap-Gerät geschlossen wird. Ein Spacer ist enthalten auf der Transfer-Folie, die Aufrechterhaltung einer Mikrometer Größe Lücke, die es zuverlässige Tröpfchen-Übertragung auf dem Objektträger erlaubt. Schließlich sollen den Käfig und seine Schließung Registerkarte Druck für die wirksame Übertragung auf jede Snap für reproduzierbare, qualitativ hochwertige Übertragung benötigt. Ein Foto von der Snap-Apparat ist in Abbildung 3dargestellt.
Repräsentative Bilder illustrieren die Ergebnisse des Reagens auf eine Nitrozellulose-Folie und einem Objektträger übertragen sind in Abbildung 4dargestellt. Alexa 532 beschriftet IgGs dienten als das erste Reagenz und Alexa 647 beschriftet IgGs dienten als dem zweiten Reagenz. Nach der Übertragung wurde das Dia gescannt mit 532 nm und 635 nm Laser. Das Ergebnis zeigt, dass 3136 (für die Nitrozellulose-Folie) oder 1024 (für die Glas-Folie) Microspots mit Null Fehler auf der Assay-Objektträger übertragen wurden und keine Kreuzkontamination wurde nach der Übertragung der zweiten Reagens beobachtet. Bei der Verwendung von Glas-Objektträger ist es möglich, mehr hydrophobe Oberfläche durch Funktionalisierung, damit jeder Spot zu verkleinern und Verringerung den Punkt-zu-Punkt-Abstand für die Übertragung einer größeren Anzahl von Flecken zu schaffen. Diese Arbeit erweitert die Anwendung der Snap-Chip-Technologie für häufig verwendete Glassubstrate.
Standardkurven von einer 50-Plex Immunoassay targeting Brustkrebs verwandte Proteine in Abbildung 5, entspricht das größte Multiplex-Sandwich Antikörper Microarray bisher ohne Kreuzreaktivität dargestellt sind. Doppel-Transfer-Methode wurde in diesem Test verwendet, das Dia gescannt wurde, und der Fluoreszenzintensität wurde quantifiziert, um die standard Kurven zu erzeugen. 35 von 50 Proteine LODs bei Pg/mL erreicht (siehe Tabelle 1) und kann weiter verbessert werden, indem der Assay-Bedingungen zu optimieren. NS1 Reagenzien erleichtert die Verwendung von mehreren Antikörper-Paare auf einer einzelnen Folie ohne Kreuzreaktivität und ermöglicht die Optimierung jedes Paares unabhängig mit keine Störungen auf andere Paare12. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Snap-Chip ist eine skalierbare Technologie für Multiplex Protein Quantifizierung verwendet werden können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schaltplan der Testverfahren Vergleich Single (a) und (b) doppelte Transfermethoden. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Schaltplan zeigt Unterschiede zwischen Einzel - und Doppel-Transfer. (a) Spiegelung der Übertragung Reagenzien verstärkt die eckigen Versatz zwischen der Folie und der Inkjet-Kreuztisch. (b) Doppel-Transfer-Methode überwindet die eckigen Versatz. Adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Foto von der Snap-Apparat. (a) geöffneten Gerät. (b) geschlossenen Gerät. (c) perspektivische Ansicht des Gerätes. Kurz, übertragen (i) Dias in den Diahalter positioniert und drückte gegen Passstifte mit der Pogopin auf Kolben montiert. (Ii) die Assay-Folien sind auf der Pogopins platziert und drückte gegen die Passstifte mit einem zweiten Satz von Kolben. (Iii) die Oberschale ist auf den Diahalter positioniert und eingefügt in den Käfig. Ein Druck ist mithilfe der Registerkarte "Schließung" zu komprimieren, die Pogopin und die Folien zusammenzubringen. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Kollektive Übertragung von Flecken mit einem Snap-Chip. Fluoreszenz-Scan mit 532 nm und 633 nm Laser, Übertragung von Antikörpern auf ein (a) Nitrozellulose demonstrieren Folie (adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis) und (b) Glas schieben. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Fluoreszenzbild ein Assay-Folie und Standardkurven 50 Proteine gemessen parallel mit doppelten Übertragungsmethode. (a) Fluoreszenzbild ein Assay-Folie für die Generierung einer Standardkurve. (b) Nahaufnahme eines Arrays. Maßstabsleiste = 2 mm. (c) Standard-Kurven für 50 Proteine. Fehlerindikatoren wurden als Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten berechnet. Adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56230/56230fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteinnamen</td>
			<td>Start-Konzentration (ng/ml)</td>
			<td>LOD (Pg/ml)</td>
			<td>Proteinnamen</td>
			<td>Start-Konzentration (ng/ml)</td>
			<td>LOD (Pg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANG2</td>
			<td>500</td>
			<td>1.3 × 104</td>
			<td>IL-6b</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr></tbody></table>	<td>BDNF</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 102</td>
			<td>IL-5</td>
			<td>50</td>
			<td>77</td>
		
		<tr>
			<td>CA 15-3 *</td>
			<td>1</td>
			<td>4,9 × 103</td>
			<td>IL-4</td>
			<td>1000</td>
			<td>1,5 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEA</td>
			<td>1000</td>
			<td>5,4 × 103</td>
			<td>IL-2</td>
			<td>50</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10/IP-10</td>
			<td>50</td>
			<td>1.7 × 102</td>
			<td>ME1</td>
			<td>200</td>
			<td>4,0 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRP</td>
			<td>200</td>
			<td>44</td>
			<td>MIG</td>
			<td>500</td>
			<td>11 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GER</td>
			<td>1000</td>
			<td>6.2 × 102</td>
			<td>CCL3/MIP-1Α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50</td>
			<td>1.8 × 102</td>
			<td>CCL4/MIP-1Β</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>200</td>
			<td>1.9 × 102</td>
			<td>MMP-3</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAS-L</td>
			<td>500</td>
			<td>4,5 × 102</td>
			<td>M-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>8.2 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 103</td>
			<td>MMP-9</td>
			<td>200</td>
			<td>3.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>39</td>
			<td>CCL2/MCP-1</td>
			<td>50</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>50</td>
			<td>3.8</td>
			<td>NCAM-1</td>
			<td>500</td>
			<td>1.7 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRO-Α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.0 × 102</td>
			<td>Β-NGF</td>
			<td>200</td>
			<td>1.4 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2</td>
			<td>500</td>
			<td>3,5 × 103</td>
			<td>NT-3</td>
			<td>200</td>
			<td>5.8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>200</td>
			<td>73</td>
			<td>OPN</td>
			<td>500</td>
			<td>1.9 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1Β</td>
			<td>500</td>
			<td>7.9 × 102</td>
			<td>RBP4</td>
			<td>200</td>
			<td>1.2 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1ra</td>
			<td>200</td>
			<td>1.1 × 103</td>
			<td>SPARC</td>
			<td>1000</td>
			<td>4,6 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>50</td>
			<td>8.2 × 102</td>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>50</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>TNF-RI</td>
			<td>50</td>
			<td>1.3 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-11</td>
			<td>500</td>
			<td>1.2 × 103</td>
			<td>TNF-RII</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>500</td>
			<td>6.1 × 102</td>
			<td>FAS/TNFRSF6</td>
			<td>200</td>
			<td>2.8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>50</td>
			<td>6.6</td>
			<td>uPA</td>
			<td>200</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-7</td>
			<td>2.5</td>
			<td>26</td>
			<td>uPAR(CD87)</td>
			<td>200</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6eine</td>
			<td>1000</td>
			<td>84</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>200</td>
			<td>6.7 × 102</td>
		</tr>
	

Tabelle 1. Proteinkonzentrationen und LODs in Puffer aus den 50-Plex-Assay. Die Detailgenauigkeit für CA 15-3 ist in U/ml (*). Adaptiert von Referenz 14 mit Erlaubnis.

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Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.4K Aufrufe.  McGill University and Génome Québec Innovation Centre. Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Serie: Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array technology employed combines the advantages of microsphere-based suspension array fabrication with the use of fluorescence microscopy. As described in the video protocol, commercially available 4.5 &#956;m polymer microspheres were encoded into seven different types, differentiated by the concentration of two fluorescent dyes physically trapped inside the microspheres. The encoded microspheres containing surface carboxyl groups were modified with monoclonal capture antibodies through EDC/NHS coupling chemistry. To assemble the protein microarray, the different types of encoded and functionalized microspheres were mixed and randomly deposited in 4.5 &#956;m microwells, which were chemically etched at the proximal end of a fiber-optic bundle. The fiber-optic bundle was used as both a carrier and for imaging the microspheres. Once assembled, the microarray was used to capture proteins in the saliva supernatant collected from the clinic. The detection was based on a sandwich immunoassay using a mixture of biotinylated detection antibodies for different analytes with a streptavidin-conjugated fluorescent probe, R-phycoerythrin. The microarray was imaged by fluorescence microscopy in three different channels, two for microsphere registration and one for the assay signal. The fluorescence micrographs were then decoded and analyzed using a homemade algorithm in MATLAB.

We describe a procedure for profiling salivary proteins using multiplexed microsphere-based antibody arrays. Monoclonal antibodies were covalently linked to fluorescent dye-encoded 4.5 &#x03BC;m polymer microspheres using carbodiimide chemistry. The modified microspheres were deposited in fiber-optic microwells to measure protein levels in saliva using fluorescence sandwich immunoassays.

Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Forschung

Chemie

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Experimentelles Protokoll zum Nachweis<em&gt; Cyanobakterien</em&gt; In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Umwelt

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biochemie

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Biotechnik

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Krebsforschung

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, physiological index and clinical biomarker detection. In this protocol, we provide a detailed description of the steps to develop a rapid, sensitive and quantitative lateral-flow immunoassay (using AuNPs as a marker and mAbs as a probe). The procedure describes the preparation and characterization of colloidal gold, synthesis of the AuNP-mAb conjugate, assembly of the immunochromatographic strip, and methodological investigation of the assay. The results showed that the final strips can be further utilized for the rapid and convenient self-diagnosis of a small molecule, which may provide an alternative tool in the rapid and precise analysis of physiological and biological indices.

Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Immunologie und Infektion

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Biologie

Multiplex-Immunoassay für Borrelien-spezifisches IgG und IgM im Serum

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

Autor im Rampenlicht: Erweiterung des Anwendungsbereichs von Multiplex-Immunoassays für die Lyme-Borreliose-Diagnostik und die Erregerforschung 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

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Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Experimentelles Protokoll zum Nachweis

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test