Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

Biz Lewis-Sigler Enstitüsü Princeton Üniversitesi'nde bütünleştirici genomik sıralama çekirdek tesisi için teknik danışmanlık ve RNA Kütüphane hazırlık ve sıralama için teşekkür ederim. Bu eser hibe Rowan Üniversitesi ve NIH NIGMS R15GM113187 M.J.H. tarafından desteklenmiştir

1. inducing hipoksi
<ol><li>Bir gün veya daha önce hipoksi zamanlı Kurs: kuluçka makinesi hazırlamak, hücre filtreleme sistemi, vakum, gaz tankı, şişeler, stoper, cam boru ve kablo kanalları, Malzemeler tabloolduğu gibi.</li>
	<li>N2 tank, İnkübatör, vakum ve filtreleme sistemi hücreleri hızlı işlenmesini etkinleştirmek için birbirine yakın yerleştirin.</li>
	<li>Steril sıvı YPD medya (%1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz) bir cam şişe ve ısıyla bileşenlerinde karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Şişeler kuluçka düzeni planı. Not: N2 tank ilk şişeye su tuzak olacak, ikinci şişeye son zaman noktası olacak, üçüncü şişeye ikinci son zaman noktası ve benzeri bir son su tuzağı son şişeye kadar olacak. Şekil 1 sipariş ve bağlantılar arasında şişeler gösterir.</li>
	<li>Zaman ders, önceki gün 5 mL sıvı YPD steril bir test tüpü içinde kültürünün içine maya kolonisi aşılamak. Özellikle, tam bir koloni steril aplikatör stick kullanarak bir plaka almak. Sopayı sıvı YPD içine yerleştirin ve hücrelerin çoğu süspansiyon kadar sopa sallamak.</li>
	<li>30 ° c gece (~ 16 h) tüpler döndürün. Not: 16 h sonra çok bulutlu etik, kültürler tarafından belirtilen doygunluk (~ 2 x 108 hücre/mL), wildtype hücreleri elde edecek. Diğer suşları doygunluk ulaşmak için daha uzun sürebilir ve bir Spektrofotometre ile hücre konsantrasyonu ölçerek 1.9.4 adımda gösterildiği gibi test edilmelidir.</li>
	<li>16 h, kuluçka, seyreltik sonra doymuş kültür zaman ders gününde 4 mL yerleştirmek için 5 mL damlalıklı kullanarak 1:50 kültür 196 mL steril 500 mL şişe içinde sıvı YPD içine bir gecede. 4 h 30 ° C'de için ~ 200 devirde sallayarak ile büyümek Not: 4 h sonra wildtype kültür ~ 1-2 x 107 hücre/mL orta günlük konsantrasyon ulaşacak.</li>
	<li>4 h kuluçka sırasında etiket (için hipoksi ve su tuzakları) şişeler ve 50 mL koleksiyonu tüpler. Kuluçka makinesi 1.7 yukarıdaki hipoksi zamanlı Kurs için kullanılırsa, diğer kuluçka açın ve 30 ° C'ye ayarlayın</li>
	<li>
Hipoksi için hücreleri tabi önce:
	<ol>
<li>~ 50 mL su iki su tuzakları hizmet edecek steril 250 mL şişe ekleyin.</li>
		<li>Doldurmak 1/3 bir buz kovası ile sıvı azot ve 50 mL santrifüj tüpleri tutmak için polistren köpük raf daldırın.</li>
		<li>Hücreleri toplamak için filtre sistemi ayarlayın. Steril cımbız kullanarak filtrasyon sistemi alt birimi yalnızca filtre disk kenarlarının dokunmak dikkatli steril filtresi diske ekleyin. Filtre üst birimi filtresi alt birim üzerine yerleştirin ve sistemi ile sağlanan kelepçeler ile güvenli. Böylece sıkı bir mühür ve hiçbir sızıntı alt ve üst birimleri hizalandığından emin olun.</li>
		<li>Hücre konsantrasyonu ile Spektrofotometre ölçmek. Böylece Spektrofotometre-OD600 ~0.2 - 0,6, bağlı olarak Spektrofotometre arasında doğrusal dizi ölçülen hücreleri oranında seyreltin. Not: Bir OD600 ~ 3 x 107 hücre/mL, hücre morfolojisi ve Spektrofotometre bağlı birimdir. OD600 ~0.33 - 0.66, karşılık gelen bir konsantrasyon ~ 1-2 x 107 hücre/mL bekleniyor.</li>
		<li>
Hızlı bir şekilde zaman 0 örneğinin elde edilir.
		<ol>
<li>Filtre sistemi güçlü (~ 10 mbar) elektrikli vakum tüp ve 1000 mL şişe tuzak üzerinden bağlayın. Vakum üzerine açın. Kültür (genellikle ~ 20 mL) üst birim içine dökün ve sıvı filtreden çekilecek bekleyin (~ 10 s, vakum gücüne bağlı olarak).</li>
			<li>Dikkatle temiz cımbız ile filtre diski çıkarın ve bir 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Hemen sıvı azot batık raf santrifüj tüpü yerleştirin. Önemlisi, tüpler tüpler patlayacak gibi filtre eklemeden önce önceden soğuk değil.</li>
			<li>Sonra > 30 s, yer-80 ° C dondurucu daha sonra RNA çıkarılması için tüpe. Her filtrasyon sonra temiz ve filtre sistemi yenilemek. Sistem, su için 10 çekerek durulama s filtre disk olmadan. Son olarak, sistem bir kağıt havlu ile kuru silin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Böylece her şişeyi orta günlük konsantrasyon (~ 1-2 x 107 hücre/mL) hipoksi belirtilen süre noktada ulaşır çeşitli zaman noktaları için farklı şişeler içine 4 h kültür sulandırmak. Not: Tablo 1 yaban tipi S288C HAP1+ haploit zorlanma için kullanılan dilutions gösterir. Bu her zorlanma bu hipoksik kültür koşullarında test etmek ve dilutions ona göre ayarlamanız önerilir.</li>
		<li>Hücreleri ve medya Şişeler için eklenen sonra eklenen iki cam tüp içeren bir tıpa ile açılış şişeye kapsayan alüminyum folyo yerine.</li>
		<li>Daha önce belirlenen düzeninde kuluçka şişe yerleştirin.</li>
		<li>Güvenli bir şekilde boru şekil 1' de gösterildiği gibi bağlayın.</li>
		<li>Tüm stoper sıkıca şişesi açıklıklar itilir kontrol edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0 zamanında regülatör Vanayı aç. Sonra AKIS METRESI 3 L/dak için ayarlayın. Not: Bubbling her iki su şişe uygun gaz akışını gösteren gözlenir. Yoksa, Bütün stoper sıkı ve boru düzgün takıldığından emin olun.</li>
	<li>Kuluçka makinesi kapatın ve sallama hızını ~ 200 rpm. Bir sayacı başlatmak.</li>
	<li>Her zaman noktası önce filtre sistemi yukarıda adım 1.9.3 tanımlamak olarak ayarlayın.</li>
	<li>
Her zaman noktası (örneğin, 5 dk, 10 min, vb), süreç hızlı hücreleri aşağıdaki gibi iki kişi var:
	<ol>
<li>First person: sahibinden uygun şişeyi kaldır ve tıpa (ile cam tüp bağlı) almak. Not: Bu N2 akışının won't break herhangi kalan kültür şişeler ancak geçici olarak akışını son su tuzak için ara veriyoruz.</li>
		<li>Şahıs: Kültür 1 mL damlalıklı ve bir küvet dağıtmak. Şimdi satırın sonunda son su (bir tüp ve bu süreç içinde kaldırılması bir tıpa olacak.) tuzağı kültür balonun üzerinden boru yeniden bağlayın. Sonra hücre konsantrasyon küvet yukarıda 1.9.4. adımda açıklandığı gibi ölçmek.</li>
		<li>First person: kalan kültür vakum filtrasyon sistemi dökün ve filtreleme ve yukarıda 1.9.5. adımda açıklandığı gibi buz gibi gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaman zaman puan ile bitmiş, N2 gaz kapalı dön. Regülatör kapatın ve basınç serbest bırakmak bekleyin ve ardından akış metre açın. Son olarak, sistem sökmeye ve su ve % 70 etanol ile tüm malzemeleri temiz.</li>
</ol>2. RNA çıkarma
<ol><li>RLT arabellek RNA sütun arıtma için Malzemeler tabloaçıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Dnaz hisse senedi çözüm 10 µL arabelleği RDD örnek başına 70 µL ekleyerek Dnaz çalışma çözeltisi hazırlamak ( Malzeme tabloyabakın).</li>
	<li>Filtreler ve-80 ° C dondurucu hücreleri içeren 50 mL tüpler kaldırın ve (~ 15 tezcan) Buza koyun. Buz üzerinde tüp ile aşağıdaki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>2 mL vidalı kapak tüpler etiket ve buz, her örnek için bir tüp üzerinde koyun. Asit yıkanmış boncuk ~0.6 mL kepçe ve boncuk ölçmek için 1.5 mL microcentrifuge tüp kullanarak her tüp için ekleyin.</li>
	<li>Soğuk RLT arabellek 0.6 mL 50 mL tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Damlalıklı yukarı ve aşağı hücreleri filtreden kaldırın ve çözümde askıya için. Filtre çözüm kadar emmek şekilde çözümde kalır filtre izin kaçının. Tüm çözüm kaldırma tüp duvara filtre sıkmak için damlalıklı ipucu kullanarak filtre içine emilir.</li>
	<li>Tüm sıvı boncuk içeren vidalı kapak tüpler 50 mL tüp sizden aktarın.</li>
	<li>Vidalı kapak tüpler bir boncuk değirmen homogenizer yerleştirin ve bir dakika çalıştırın. Hemen tüpler buz üç dakika yerleştirin. Yine, tüpler homogenizer yerleştirin ve bir dakika çalıştırın.</li>
	<li>Homogenizer ve 5 min için buz üzerinde yer tüpler kaldırın. Boncuk tüplerinin altına razı olacak.</li>
	<li>Oda sıcaklığında adımları geri kalanını gerçekleştirmek.</li>
	<li>Sadece lysate (~ 350 µL), damlalıklı ile transfer için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp boncuk kaçınarak.</li>
	<li>Microcentrifuge max hız ve sonra aktarmak süpernatant yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp, 2 dk için.</li>
	<li>%1 70 etanol (200 kanıt moleküler biyoloji-grade etanol yapılan) hacmi ekleyin. De pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Nakletmek belgili tanımlık eriyik ve herhangi bir 2 mL toplama tüp yerleştirilmiş bir RNA sütun için acele.</li>
	<li>Santrifüj (tüp sıvı) 15 s ≥12, 000 x g ve akışı üzerinden atmak için.</li>
	<li>350 µL arabelleği RW1 sütununu ekleyin. Santrifüj 15 s ≥12, 000 x g ve akışı üzerinden atmak için.</li>
	<li>80 µL eklemek Dnaz ben sütun membran karışıma kuluçka (Tüp iki tarafında alamadım) ve 15dk için oturmak için izin verir.</li>
	<li>350 µL arabelleği RW1 sütununu ekleyin. Microcentrifuge 15 ≥12 s, 000 x g ve akışı üzerinden atmak için.</li>
	<li>Arabellek RPE 500 µL sütununu ekleyin. Microcentrifuge 15, ≥12 s, 000 x g ve atma için akış yoluyla.</li>
	<li>Arabellek RPE 500 µL sütununu ekleyin. Microcentrifuge ≥12, 000 x g, 2 dk için.</li>
	<li>Dikkatle sütun kaldırın ve yeni bir 2 mL toplama tüp içine yerleştirin. (Membran kurumasını için) Microcentrifuge 1 dk için tam hızda.</li>
	<li>Toplama tüp atın ve sütun 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin. Su RNase free 30 µL sütun membran için ekleyin.</li>
	<li>Sütundaki RNA microcentrifuging ≥12, 000 x g, 1 dk. için tarafından elute. Sütunları microcentrifuge yüklenirken, koleksiyon tüp kapakları kapakları kopması önlemek için santrifüj döner yönde dönük emin olun.</li>
	<li>Başka bir 30 µL RNase free su sütunu aynı microcentrifuge tüpte tutarken sütun membran için ekleyin.</li>
	<li>Microcentrifuge, ≥12, 000 x g, 1 dk. için böylece 60 µL son eluate birimdir.</li>
	<li>-80 ° C dondurucu RNA'ın 60 µL içeren her 1,5 mL tüp depolamak.</li>
</ol>3. belirleyici RNA konsantrasyon ve kalite
<ol><li>RNA ve DNA toplama her RNA örneğinde, (a) bir yer, (b) DNA ve RNA özel floresan boyalar ve (c) tahlil tüpler, Malzemeler tablokullanarak ölçmek. Yer ve boyalar uyunuz.</li>
	<li>Alternatif olarak, 260 ayarla bir UV Spektrofotometre ile nükleik asit konsantrasyonu ölçmek nm. Not: Bir A260 okuma 1.0 ~ 40 µg/mL tek iplikçikli RNA için eşdeğerdir.</li>
	<li>Test RNA kalitesi üzerinde bir ticari nükleik asit analyzer RNA çalıştırarak ( Malzeme tabloyabakın) veya standart bir formaldehit/özel 26jel.</li>
</ol>4. RNA-seq analizi
<ol><li>Toplam RNA stoktan 100 ng/µL RNA RNase free suda 21 µL oluşturur. Bu 21 µL 1 µL RNA konsantrasyon yukarıdaki gibi sınamak için kullanın. Kalan 20 µL (2 µg) toplam RNA bir mRNA zenginleştirme için dış sıralama Merkezi, strand özel kütüphane hazırlıkla (çoğullama için sekiz veya daha fazla barkod) göndermek ve sıralamanın ( Malzeme tabloyabakın). Alternatif olarak, yerel olarak mRNA zenginleştirme ve Kütüphane hazırlık gerçekleştirmek ve sonra kitaplık sıralama için gönderin.</li>
	<li>Sekiz veya daha fazla çoğaltılmış örnekler ve yeni nesil Sekanslama tek şeritli sırayla Havuzu.</li>
	<li>Tüm sıra okuma ve karşılık gelen dizin okuma içeren FASTQ dosyasını indirin. Ayrıca, multiplex barkodları içeren metin dosyasını indirin. Not: Dizin okuma ayrı bir FASTQ dosyada mevcut olabilir. Tüm bu dosyaları bir dizine yerleştirin.</li>
	<li>Burada, "fastq_pipeline.sh", aynı dizinde sağlanan kabuk komut dosyasını yerleştirin. Bu script deneme ve bilgisayar dizinleri için uygun şekilde düzenleyin. Not: Bu komut dosyası adımları açıklayan kapsamlı ek açıklamaları içerir. Kısacası, komut dosyası kalite okuma kırpar, okuma için genom haritaları ve her örnek için gen başına okuma sayısı içeren sekmeyle ayrılmış bir dosya oluşturur.</li>
	<li>FASTQ dosya ve ham okuma sayısı verileri NCBI'ın gen ifade Omnibus yayın 27önce Emanet. "GEO için yüksek üretilen iş sırası veri gönderilmesi" yönergelerini izleyin: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>R istatistiksel ortama okuma sayısı verileri alabilir ve istatistiksel analiz, burada, "time_course_script. sağlanan R komut dosyası kullanma "R". Bu script deneme ve bilgisayar dizinleri için uygun şekilde düzenleyin. Not: Bu komut dosyası adımları açıklayan kapsamlı ek açıklamaları içerir. Kısacası, bu komut dosyası okuma verileri alır, okuma normalleştirir, önemli ölçüde zaman boyunca değiştirmek, PCA analiz yapan ve seçili genlerin ifade grafikler genler tanımlar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing,+homeostasis,+and+disease.">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li><li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes.">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li><li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals:+the+implications+of+physiology+for+cancer.">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li><li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae.">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li><li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li><li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li><li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae:+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response.">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li><li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions:+effects+of+hap1,+rox1,+rox3+and+srb10+deletions.">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li><li>Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae:+differential+response+and+role+of+Msn2+and/or+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media.">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li><li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li><li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor.">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li><li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li><li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response.">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li><li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+proteins,+Spt23p+and+Mga2p,+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator.">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li><li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN/TIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li><li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast.">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li><li>Gaisne, M., B&#233;cam, A. M., Verdi&#232;re, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;natural&amp;#34;+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+(CYP1).">A &amp;#34;natural&amp;#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>. R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization.">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+Genome+Database:+the+genomics+resource+of+budding+yeast.">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li><li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li><li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns.">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li><li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li><li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li><li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li><li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains.">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li><li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+RNA.">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=timeClip:+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates.">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, (2014).</li><li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq:+a+statistical+approach.">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, mRNA düzeyleri tüm genler için sırasında hipoksi S. cerevisiaeMaya olarak ölçüldü. Nasıl küresel gen ifade değişiklikleri anoksik kontrollü bir ortamda büyüme nedeniyle analiz etmek için hedefi oldu. Burada anlatılan yöntem dikkatle kontrollü ve tekrarlanabilir emin olmak için çeşitli adımlar atılmıştır. İlk olarak, hücrelerin tam olarak tanımlanmış bir hipoksik ortamına maruz kaldılar: %99,999 N2 zengin medya (YPD). Hipoksi diğer çalışmaların ?...

Çoğu organizma gen ifade 1,2,3değiştirerek hipoksi veya düşük O2, cevap verin. Bu yanıtı hücreleri bir substrat kritik birkaç biyosentetik reaksiyonlar ve Aerobik solunum için eksikliği ile aynı zamanda değişen bir Redoks devlet 4ile baş yardımcı olur. S. cerevisiae içinde gerçekleştirilen çeşitli Mikroarray çalışmalarda genler yüzlerce mRNA düzeyde hipoksi 5,6,7,8,9 yanıt olarak değiştirmek göstermek , 10 , 11 , 12. son zamanlarda, RNA-seq hipoksi 13sırasında zamanla gen ifade değişiklikleri tanımlamak için kullanıldı. Burada, deneysel detayları sunulmuştur ve tartışılmaktadır.
Hipoksi çeşitli şekillerde, her O2farklı bir düzeyde üreten elde edilebilir. Burada, hipoksi sürekli akan tarafından kurulmuştur [O2] düşüren ultra yüksek saflıkta N2 şişeler, içine çözünmüş hemen tekrarlanabilir Kinetik 10ile. Metabolizma ve gen ifade için katkıda bulunan bazı O2 molekülleri mevcut vardır ama bu ortamda çok yakın anaerobik olarak kabul olabilir. O2yokluğunda, Maya hücreleri biosynthesize heme, ergosterol ve doymamış yağ asitleri 4,12,14olamaz. Böylece, önceki çalışmalarda bu metabolitler Maya oksijen 5,10,15olmadan büyüyen dahil ettik. Ancak, birçok hipoksik yanıtları bu metabolitler tükenmesi tarafından aracılık ve böylece onları Yenileyici hipoksik gen ifade yanıt-e doğru 12,16tersine çevirir. Doğal hipoksi taklit etmek için bu metabolitler medyaya eklenmedi. Hücreler bu temel metabolitler varlığı olmaksızın hipoksi sinin kısa sürede hücre ölümü (veri gösterilmez) ne de uzun süreli stres yanıt 13fark hiçbir artış oldu.
Yanıt zorlanma ve tamamına onun genotipi bağlıdır. Hipoksik yanıt 2bilinen düzenleyiciler allelleri özellikle önemlidir. Böylece sonuçları bu gerilme ile gerçekleştirilen diğer genomik çalışmalar için karşılaştırılabilir S288C zorlanma arka plan son derece arzu edilir. Ancak, S288C HAP1 gen 17, hipoksik yanıt için kritik bir transkripsiyon regülatör kısmi bir işlev kaybı alleli içerir. Bu gen S288C içinde onarıldı bir wildtype kullanarak Σ1278b kopyadan zorlanma arka plan 11.
Gen ekspresyonu hücresel ortamı son derece bağlıdır. Böylece, genom çapında mRNA analiz yapılırken, zaman, uyarıcı veya genotip gibi başka bir parametre değişen süre sabit bir ortam sağlamak önemlidir. Son derece tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çalışma için üç Bu yöntemler ve tüm onun biyolojik veya teknik çoğaltır göz önünde bulundurun. İlk olarak, teknik uygulamaları Denemecileri arasında farklılık bu yana aynı experimenter(s) çalışma taşımalıdır. İkinci olarak, her toplu iş iş gen ekspresyonu etkileyebilir biraz farklı bir kompozisyon olduğu gibi maddeler aynı toplu iş büyüme medyada kullanılmalıdır. Üçüncü olarak, hücre döngüsü etkileri en aza indirmek için her zaman noktası zaman uyumsuz hücrelerinin büyüme (1-2 x 107 hücre/mL) orta günlük aşamasında oluşmalıdır.
Hipoksi gen ifade yanıt gibi karmaşık bir yanıt karakterize, bir zaman ders çeşitli etkinlikler Kinetik belirlemek için avantajlıdır. Belirli zaman puan bu yanıtın önemli değişiklikler yakalayacaktır seçilmelidir. Son deneyler sırasında bu dönem 13gen ekspresyonu yaygın değişimler ortaya çünkü bu çalışmada, zaman puan 0 ve 4 h arasında gözlendi.
Küresel gen ekspresyonu ölçmek için kullanılan 18,19RNA-seq yapıldı. Bu yöntem yeni nesil sıralama her genin transkript göreli bolluk belirlemek için kullanır. DNA Mikroarray analizi için karşılaştırıldığında, RNA-seq (daha az bol Tutanaklar bulmak için) daha yüksek hassasiyet, büyük dinamik alan (daha fazla kat değişiklikleri ölçmek için) ve (gen ekspresyonu zaman içinde doğru bir şekilde takip etmek) üstün tekrarlanabilirlik sergiler. Genellikle, en hücresel RNA ribozomal RNA çok yöntemleri için belirli RNA türler 20zenginleştirmek için geliştirilmiştir olur. Burada, Poli-T boncuk mRNA Tutanaklar, Poli A içeren rağmen çeşitli ticari arındırmak için kullanılmıştır - kullanılabilir rRNA tükenmesi kitleri de mRNA zenginleştirme etkili olabilir.
Burada, S. cerevisiae gen ifade yanıt hipoksi olarak karakterize edildi. Hücreler için hipoksi maruz ve sekiz saat noktalarda örneklenmiş (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 ve 240 dk). Tekrarlanabilirlik onaylamak ve istatistiksel olarak değiştirilen kayıtları tanımlamak için üç biyolojik çoğaltır yapıldı. RNA mekanik bozulma ve sütun arıtma tarafından çıkarılan ve RNA-seq analiz için işlenmiş. Sonrası sıralama boru hattı anlatılan ve izin veren tam çoğaltma analizleri gerçekleştirilen programlama komut dosyaları sağlanır. Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R istatistiksel çevre 24ve 25 DESeq2 paket RNA-seq verileri işlemek için ve sırasında önemli ölçüde değiştirmek 607 genlerin tanımlamak için kullanılan özel olarak, hipoksi. Asıl bileşen analizi (PCA) ve gen ekspresyonu çoğaltır, teknik tekrarlanabilirlik göstermiştir. Aerobik solunum gibi birçok hücresel süreçler oksijen düzenlenir genler kümesinde zenginleştirilmiş gen Ontoloji (GO) çözümleme göstermek süre kümeleme ve heatmaps geniş çaplı ifade Kinetik, ortaya koydu.

<table><tbody><tr><td>Enclosed dry incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set at 30 &amp;deg;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td></tr><tr><td>Micro-analysis Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask</td></tr><tr><td>Strong vacuum</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The &amp;ldquo;house&amp;rdquo; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td></tr><tr><td>1,000 mL flask</td><td></td><td></td><td>To act as vacuum trap.</td></tr><tr><td>~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td></tr><tr><td>High-pressure N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td></td><td></td><td>99.999% purity, &gt;1,000 psi, with a regulator and gas flow controller</td></tr><tr><td>Autoclaved 500 mL flask</td><td></td><td></td><td>Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td></tr><tr><td>Autoclaved 250 mL flasks</td><td></td><td></td><td>Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td></tr><tr><td>Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td></tr><tr><td>Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td></tr><tr><td>~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Sterile filter discs</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0.45 &amp;micro;m pore size, one for each time point</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td></tr><tr><td>50 mL sterile centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>One for each time point</td></tr><tr><td>Clean and sterile tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>acid-washed beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C for lysing cells</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For RNA column purification</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare by adding 10 &amp;micro;L of &amp;beta;-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL collection tubes</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock and working solutions</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 &amp;micro;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 &amp;deg;C) in single-use aliquots (80 &amp;micro;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>Ice cold 2 mL screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td>For lysing cells during RNA extraction</td></tr><tr><td>bead mill homogenizer</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Keep in cold room</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Commercial electrophoresis system</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>for measuring nucleic acid quality</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>for sequencing libraries</td></tr><tr><td>automated liquid handling system</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>for creating sequencing libraries</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>for isolating mRNA from total RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, which includes the gzip command</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installed before TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installed before R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (free version)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

Karmaşık gen ekspresyonu değişimler genellikle bir hücresel yanıt büyük bir bölümünü aracılık. Gen bir sinyal yolları veya ikincil etkileri birçok uyaranların belirli zamanlaması tarafından düzenlenmiştir her gen ifadesi benzersiz Kinetik ile değişebilir. Tüm gen yakalamak için Maya S. cerevisiae, RNA-seq analiz hipoksi ifade yanıt hipoksi maruz kaldıktan sonra belirli zamanlarda tüm genler mRNA düzeyleri izlemek için kullanılır. Hipoksi ~ %100 N2 gaz hücrelerde büyüyen tarafından kurulmuştur. Bu metabolitler gen ekspresyonu etkilemez çünkü önemlisi, hipoksik diğer çalışmalar ergosterol ve doymamış yağ asitleri medyaya eklenmedi. O dönemde gen ekspresyonu önemli değişimler yakalar çünkü zaman puan 0 - 4 h hipoksi sonra dizi seçilmiştir. Her zaman noktada orta günlük hipoksik hücreleri hızlı bir şekilde edildi filtre ve dondurulmuş, O2 ve verebildiği gen ekspresyonu değişimler maruz sınırlayan. Toplam RNA hücrelerinden çıkarılan ve sonra cDNA için dönüştürülmüş mRNA için zenginleştirmek için kullanılır. Bu cDNA multiplex kitaplıkları oluşturulmuş olan ve sekiz veya daha fazla örnekleri yeni nesil Sekanslama bir şeritte sıralı. Sonrası sıralama boru hattı açıklanan, hangi eşleme ve okuma gen ücret belirleyerek okumak Kalite temel düzeltme içerir. DESeq2 R istatistiksel ortamında önemli ölçüde hipoksik zaman noktaları herhangi birini değiştirmek genlerin tanımlamak için kullanıldı. Üç biyolojik çoğaltır analizini ortaya yüksek tekrarlanabilirlik, farklı Kinetik genler ve çok sayıda beklenen O2-genler düzenlenir. Bu yöntemlerin nasıl çeşitli organizmalar hücrelerinin hipoksi için zaman içinde yanıt çalışırdım ve gen ekspresyonu diğer hücresel yanıt sırasında çalışmaya adapte.

Hipoksi zamanlı Kurs ve RNA-seq analiz bağımsız olarak üç kez yapıldı. Üç çoğaltır tekrarlanabilirlik incelemek için gen ifadesi verileri tüm genler için asıl bileşen analizi (PCA) kullanılarak analiz. Şekil 2 örnekleri birlikte 58.9 oranında değişkenlik gösteren ilk iki asıl bileşenleri üzerinde nasıl değişiklik gösterir. Bu analiz her zaman ders (tarafından her eğrinin şeklini benzer tasvir) benzer değişiklikler sergiley...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Burada, RNA-seq S. cerevisiae hücre hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri izlemek için bir iletişim kuralı'nı mevcut. Bu yöntem gen ekspresyonu herhangi bir hücresel yanıt sırasında analiz etmek için adapte edilebilir.

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

8.2K Görüntüleme.  Rowan School of Osteopathic Medicine. Burada, RNA-seq S. cerevisiae hücre hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri izlemek için bir iletişim kuralı'nı mevcut. Bu yöntem gen ekspresyonu herhangi bir hücresel yanıt sırasında analiz etmek için adapte edilebilir.

Video: Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biyokimya

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetik

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biyoloji

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler